MIR-155 и MIR-223 как маркеры клинических особенностей течения хронического лимфолейкоза

МикроРНК (miR) представляют собой эндогенные малые некодирующие регуляторные РНК, вовлеченные в регуляцию широкого спектра биологических процессов, включая канцерогенез [1]. Связь miR с онкологическими заболеваниями может быть опосредована аберрациями последовательностей ДНК, содержащих miR, нарушением контроля их транскрипции, дефектами биогенеза miR, наконец, нарушением регуляции эпигенетических изменений, опосредуемых miR. Зрелые miR опосредуют репрессию своих генов-мишеней, взаимодействуя с их мРНК [2, 3].

Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) – по международной классификации сhronic lymphocytic leukaemia/small lymphocytic lymphoma (CLL/ SLL) [4] – определяют как опухоль из малых В-лимфоцитов, характеризующуюся пролиферацией и накоплением аберрантных лимфоидных клеток в костном мозге, крови, лимфоидных тка- нях [5]. Хронический лимфолейкоз – неизлечимое злокачественное новообразование, на долю которого в западных странах приходится почти треть лейкозов и при котором наблюдается высокая межиндивидуальная клиническая и молекулярная гетерогенность [6–8]. Эта гетерогенность дополнительно усложняется изменением экспрессии генов и событиями эпигенетической регуляции, за которые отвечают регуляторные РНК, включая miR, выступающие в роли онкогенов либо супрессоров опухоли [9, 10].

Известные геномные биомаркеры для определения прогноза или ответа на лечение при ХЛЛ представляют собой мутации генов и хромосомные аберрации (ХА). Самым частым хромосомным нарушением является делеция 13q.14, которая ассоциирована с благоприятным прогнозом заболевания, мутациями в генах вариабельного региона тяжелых цепей иммуноглобулинов (IgVH) и типичной морфологией опухолевых клеток. Трисомия по 12 хромосоме встречается в 7–25 % случаев ХЛЛ, коррелирует с промежуточным прогнозом, атипичной морфологией клеток, яркой экспрессией CD20, хорошим ответом на ритуксимаб. Делеция 11q.22 и делеция 17р.13 встречаются в 3–15 % и 5–12 % соответственно и ассоциированы с отсутствием мутаций в генах IgVH, быстрым прогрессированием заболевания и неблагоприятным исходом. Делеция 17р.13 нарушает функцию белка ТР53 и, наряду с мутациями в гене ТР53, включена в международный прогностический индекс ХЛЛ (МПИ). В МПИ также входят такие показатели, как мутационный статус генов IgVH, стадия по Binet, возраст, уровень бета2-микроглобулина. Определение мутаций в гене ТР53 и мутаций в генах IgVH в реальной клинической практике представляет значительные трудности, в связи с чем расчет МПИ не всегда возможен.

С некоторыми из известных прогностических биомаркеров связывают ряд паттернов miR, например, с малым количеством мутаций в генах IgVH или высоким уровнем экспрессии ZAP-70 в лейкозных клетках [9]. В частности, показана связь с развитием ХЛЛ аберрантной экспрессии miR-155 и miR-223. Например, выявлены более высокие уровни экспрессии miR-223 в лимфоцитах периферической крови пациентов с низким риском прогрессирования ХЛЛ по сравнению с группой высокого риска [10]. Экспрессия miR-223 в мононуклеарах периферической крови ниже у пациентов с ХЛЛ по сравнению со здоровым контролем [11]. Интересно, что экспрессия miR-223 оказалась ниже у курящих пациентов с ХЛЛ, чем у некурящих [11].

В отличие от miR-223, уровень экспрессии miR-155 не связан со статусом IgVH [10], но есть свидетельства, что miR-155 является онкогеном при ХЛЛ [9, 12–14]. Так, при проведении полногеномного секвенирования малых РНК был идентифицирован паттерн дифференциальной регуляции восьми miR при ХЛЛ, среди которых обнаружилась активированная miR-155 [9]. Выявлена повышенная экспрессия miR-155 в сыворотке крови пациентов с ХЛЛ по сравнению со здоровым контролем; miR-155 была обнаружена в циркулирующих микровезикулах больных ХЛЛ [12]. Определены гиперэкспрессия miR-155 в лимфоцитах и в плазме больных ХЛЛ и ее связь с плохим прогнозом и прогрессированием заболевания [14].

Уровень экспрессии пяти miR человека, включая miR-155-5p и miR-223-3p, определен в сыворотке 224 пациентов с ХЛЛ и у 224 здоровых лиц. Среднее время от момента сбора крови до постановки диагноза ХЛЛ составило 10 лет. Активация miR-155-5p связана с последующим риском развития ХЛЛ, хотя прогностическая эффективность была небольшой. Уровень miR-223-3p не был связан с риском развития ХЛЛ [6]. Устойчивость miR в системном кровотоке делает их подходящими диагностическими маркерами [6, 11], и, согласно имеющимся данным, уровень экспрессии miR-155 и miR-223 может быть маркером при ХЛЛ [11, 12].

Целью исследования стало выявление возможных закономерностей различий уровня экспрессии miR-155 и miR-223 между больными с разными биологическими и клиническими особенностями ХЛЛ, характеристиками терапии заболевания, а также в костном мозге и в субстратах крови: плазме, лимфоцитах, внеклеточных везикулах у пациентов с ХЛЛ.

Материал и методы

Использовали образцы клинического материала – периферической крови и костного мозга 38 пациентов, которые с 2016 по 2017 г. получали лечение в Городском гематологическом центре ГБУЗ Новосибирской области «Городская клиническая больница № 2» – клинической базе ФГБУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава РФ. Всем пациентам установлен диагноз ХЛЛ. Диагностика ХЛЛ и показания к терапии определялись в соответствии с международными критериями IWCLL 2008 г. и российскими клиническими рекомендациями по диагностике и лечению лимфопролиферативных заболеваний [15, 16]. Материал для исследования забирали до начала терапии.

Средний возраст больных составил 62,6 ± 8,5 года (43–77 лет). Распределение по полу: 23 мужчины и 15 женщин. Наиболее частым клиническим проявлением был лимфопролиферативный синдром, включающий лимфаденопатию, которая определялась у 21 (55 %) пациента, и спленомегалию – у 20 (53 %) больных ХЛЛ. Показатели гемограммы до начала лечения представлены в табл. 1. Инфильтрация костного мозга аномальными клетками, сопровождающаяся вытеснением здоровых кроветворных клеток и выходом аномальных клеток в кровоток, определяет абсолютный лимфоцитоз, развитие анемического синдрома и тромбоцитопении у пациентов с ХЛЛ. Стадию заболевания определяли по Binet, и среди обследованных пациентов с ХЛЛ стадия A наблюдалась у 13 (34 %), стадия В – у 18 (47 %), стадия С – у 7 (18 %) больных.

Определение хромосомных аберраций проводилось с помощью стандартного цитогенетического исследования и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Пациенты разделены на 2 группы на основании потенциального влияния на прогноз выявленных хромосомных нарушений. В 1-ю группу вошли 24 (63 %) пациента с трисомией 12 хромосомы, нормальным кариотипом или генетическими аномалиями неопределенного значения, которые не ассоциированы с отчетливым благоприятным или неблагоприятным прогностическим значением, занимая промежуточную позицию. Во 2-ю группу

Таблица 1/Table 1

Показатели гемограммы и миелограммы у больных ХЛЛ

Hemogram and myelogram parameters in patients with CLL

Показатель анализа крови/Bloodwork parameter	Среднее значение/Mean	Кол-во случаев/Number of cases
Гемоглобин (120–170 г/л)/ Hemoglobin (120–170 g/L)	140,43 ± 12,13	29 (76,32 %)
Анемия легкой степени (Hb=110–90 г/л)/ Mild anemia (Hb=110–90 g/L)	102,17 ± 6,05	6 (15,79 %)
Анемия средней степени (Hb=89–70 г/л)/ Moderate anemia (Hb=89–70 g/L)	79,00 ± 4,24	2 (5,26 %)
Анемия тяжелой степени (Hb<70 г/л)/ Severe anemia (Hb<70 g/L)	50	1 (2,63 %)
Тромбоциты/ (150-400 х 10 9 /л)/ Platelets (150-400 х 10 9 /L)	140,43 ± 12,13	34 (89,47 %)
Тромбоцитопения (Тр<100 х 10 9 /л)/ Thrombocytopenia (Pt<100 х 10 9 /L)	24,75 ± 7,93	4 (10,53 %)
Лейкоциты (Lc=3-9 х 109/л)/ Leukocytes (Lc=3-9 х 10 9 /L)	5,52 ± 1,58	16 (42,11 %)
Лейкоцитоз (Lc=9-30 х 109/л)/ Leukocytosis (Lc=9-30 х 10 9 /L)	17,45 ± 6,70	15 (39,47 %)
Гиперлейкоцитоз (Lc>30 х 109/л)/ Hyperleukocytosis (Lc>30 х 10 9 /L)	108,09 ± 114,04	7 (18,42 %)
Лимфоциты крови (L=19–37 %)/ Blood lymphocytes (L=19–37 %)	5,26 ± 7,07	14 (36,84 %)
Лимфопения (L<19 %)/ Lymphopenia (L<19 %)	10,75 ± 5,85	4 (10,53 %)
Лимфоцитоз (L>37 %)/ Lymphocytosis (L>37 %)	77,10 ± 18,66	20 (52,63 %)
Лимфоциты костного мозга, %/ Bone marrow lymphocytes, %	70,33 ± 25,00	38 (100 %)

Примечание: таблица составлена авторами.

Note: created by the authors.

вошли 13 (34 %) больных с делецией 11q или де-лецией 17p, ассоциированных с неблагоприятным прогнозом заболевания. Один пациент, у которого выявлена изолированная делеция 13q, ассоциированная с благоприятным прогнозом заболевания, в дальнейший анализ не включен.

У всех пациентов определялись показания к началу терапии согласно критериям IWCLL 2008 [15], на основании которых часть больных была включена в группу с показаниями к терапии, в которую вошли 22 (58 %) пациента, и часть – в группу без показаний к терапии – 16 (42 %) человек.

Все пациенты с показаниями к терапии получили 2–8 курсов полихимиотерапии (ПХТ), использовались стандартные протоколы R-COP (ритуксимаб, циклофосфан, винкристин, преднизолон), R-FC или R-FC lite (ритуксимаб, флударабин, циклофосфан), BR (бендамустин, ритуксимаб), R-CHOP или mini R-CHOP (ритуксимаб, цикло-фосфан, доксорубицин, винкристин, преднизолон). При оценке эффективности лечения обследование пациентов проводилось согласно рекомендациям IWCLL 2008 [15].

Венозную кровь забирали в пластиковые пробирки с добавлением ЭДТА. Кровь разводили в 2 раза в PBS. В пробирку, содержащую 3 мл раствора для выделения лимфоцитов (фиколл-урографин, ООО «БиолоТ»), наслаивали кровь, не допуская смешивания жидкостей. Центрифугировали пробирку при 1000 об/мин в течение 40 мин. Лимфоциты отсасывали в сухую коническую центрифужную пробирку, добавляли 2–3 мл холодного PBS, гомогенизировали и центрифугировали при 1000 об/мин 10 мин. Надосадочную жидкость сливали, отмывку повторяли дважды. Выделение мононуклеаров костного мозга проводилось аналогичным образом.

Выделение микровезикул из плазмы крови проводили следующим образом. Кровь центрифугировали в течение 20 мин при 2500 g, затем при тех же условиях центрифугировали полученную плазму. Супернатант в количестве 0,5 мл центрифугировали при 4 °С в течение 40 мин при 13000 g, к полученному осадку добавляли 1 мл фосфатносолевого буфера и центрифугировали еще раз при 4 °С в течение 40 мин при 100000 g. Осадок (фракция микровезикул) ресуспендировали в 0,3 мл фосфатно-солевого буфера.

Суммарную РНК выделяли с помощью набора для выделения РНК Тризол («Ambion», США)

Таблица 2/Table 2

Последовательности олигонуклеотидов для проведения ОТ-ПЦР

Oligonucleotide sequences for reverse-transcription PCR

miR	Тип/Type	Последовательность (5’→ 3’)/ Sequence (5’→ 3’)	Ссылка/ References
miR-155	Адаптер/Adapter	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCCTAT	[25]
	Прямой/Forward	GCCGCTTAATGCTAATCGTG
	Зонд/Probe	[FAM]TTCGCACTGGATACGACACCCCTAT[BHQ1]
	Адаптер/Adapter	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTCAGC
miR-223	Прямой/Forward	GCCGCCGTGTATTTGACAA	[25]
	Зонд/Probe	[FAM]TTCGCACTGGATACGACAACTCAGC[BHQ1]
	Адаптер/Adapter	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGCCATGC
	Прямой/Forward	GCCGCATACAGAGAAGATTA	[26]
RNU6-1	Зонд/Probe	[FAM]TTCGCACTGGATACGACGGCCATGC[BHQ1]
	Обратный (общий)/Reverse (common)	AGTGCAGGGTCCGAGGTA	[27]

Примечание: таблица составлена авторами.

Note: created by the authors.

согласно инструкции производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили с помощью обратной транскриптазы M-MuLV–RH «Promega» (США) согласно инструкции производителя с модификациями. В реакции использовалось 8 пкмоль микроРНК-специфичного праймера-адаптора шпилевидной конструкции (последовательности представлены в табл. 2.), 25 е.а. ингибитора РНКаз и 1 нг РНК. Смесь инкубировали в течение 30 мин при 18 ºC, затем в течение 30 мин при 42 ºC и 5 мин при 85 ºC.

Оценка экспрессии генов проводилась при помощи ПЦР в реальном времени по принципу TaqMan на оборудовании iCycler CFX96 real-time PCR detection system (Bio-Rad Laboratories, USA). В качестве гена домашнего хозяйства (эталонного гена) использовалась малая ядерная РНК U6, одна из наиболее часто используемых в этом качестве при анализе miR [17]. Реакцию проводили в следующих условиях: начальная денатурация при 95 °С в течение 3 мин, затем 40 циклов: денатурация при 95 °С в течение 15 с и отжиг при 60 °С в течение 30 с. Каждый образец амплифицировали трижды. Для оценки экспрессии применялся показатель ΔCT. Метод 2^-ΔCT используется для относительного количественного анализа данных ПЦР в реальном времени [18]. При данном методе используется информация о CT, полученная из системы при проведении ПЦР в реальном времени, для вычисления относительной экспрессии генов в целевых и эталонных образцах с использованием эталонного гена в качестве нормализатора. ΔCT=CT (ген-мишень) – CT (эталонный ген).

Статистическую обработку проводили с использованием программного пакета для статистической обработки STATISTICA software, MS Excel и GraphPad Prism 10. Характер распределения данных определяли с использованием критерия

Колмогорова–Смирнова с поправкой Лиллифор-са. Проводилась оценка значимости различий групп с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни либо непараметрического критерия Краскела–Уоллиса с последующим попарным сравнением с помощью критерия Манна–Уитни. При представлении результатов в виде X ± m показатель вариабельности m представляет собой среднеквадратичное отклонение. Значения уровня экспрессии miR-155 и miR-223 представлены в виде медианы и 1 и 3 квартилей – Me (Q1; Q3).

Результаты

На рис. 1 представлены значения уровня экспрессии miR-155 и miR-223 в субстратах крови (плазма, лимфоциты, внеклеточные везикулы) и костном мозге в общей выборке больных ХЛЛ. Оценка с помощью критерия Краскела–Уоллиса показала значимость различий – p=0,03 для экспрессии miR-155 и р=0,83 для экспрессии miR-223. Попарное сравнение с помощью U-критерия Манна–Уитни выявило, что наибольший уровень экспрессии miR-155 наблюдается в лимфоцитах периферической крови – 225,97 (17,15; 3902,01), где он на порядок выше, чем в плазме крови, – 11,47 (0,36; 156,33; p=0,01) и во внеклеточных везикулах – 6,63 (0,08; 221,32; p=0,01) (рис. 1А). Различий уровня экспрессии miR-223 в исследованных субстратах не выявлено (рис. 1Б).

Исследована возможная связь уровня экспрессии miR-155 и miR-223 со стадией ХЛЛ, отражающей распространенность и прогрессию опухоли, а также медиану общей выживаемости, которая на А стадии не отличается от общепопуляционной, на стадии В составляет 7 лет, на стадии С – 2 года (по Binet). Оценка с помощью критерия Краскела– Уоллиса показала отсутствие достоверных различий в группах пациентов с разными стадиями

Рис. 1. Относительный уровень экспрессии микроРНК miR-155 (А) и miR-223 (Б) в субстратах крови (плазма, лимфоциты, внеклеточные везикулы) и костном мозге у больных ХЛЛ.