Mitochondria as a possible place for initial stages of steroid biosynthesis in plants

В последнее десятилетие получен ряд экспериментальных данных об определённой структурной и функциональной консервативности путей биосинтеза биологически активных стероидных соединений в растениях и у животных. Установлено, что основные стадии в процессах биосинтеза и метаболизма стероидных гормонов животных и брассиностероидов растений катализируют цитохромы Р450, в обеих системах функционируют такие ферменты, как стероид-5α-редуктаза (5αR) и 3β-гидроксистероид-дегидрогеназа /∆5-∆4-изомераза (3β-HSD). Также убедительно доказано, что в растениях наряду с брассиностероидами присутствуют такие стероидные гормоны животных, как прогестерон, 17-гидроксипрогестерон, 16-дегидроксипрогесте-рон и андростендион (Simerský et al., 2009; Pauli et al., 2010). Пути биосинтеза этих соединений и их роль в жизнедеятельности растений пока не изучены. На сегодняшний день установленным является лишь то, что прогестерон выполняет важные функции в регуляции процессов роста и развития растений: например, экзогенный прогестерон стимулирует рост и созревание пыльцы растений табака (Ylstra et al., 1995). Совокупность этих данных делает актуальным создание и исследование трансгенных растений, экспрессирующих гены стероидогенных белков животных. С одной стороны эти растения являются удобной моделью для изучения процессов биосинтеза и функций стероидных гормонов животных в растениях. С другой стороны подход, основанный на применении генов белков стероидогенеза животных, может привести к созданию трансгенных растений, обладающих важными для сельского хозяйства свойствами, а в случае лекарственных растений – свойствами, важными для производства медицинских препаратов из растительного сырья. Не исключено также и то, что культура тканей этих трансгенных растений может найти биотехнологическое применение для осуществления трансформации различных стероидных соединений или их наработки.

Ключевую роль в биосинтезе стероидных гормонов животных играет цитохром P450 SCC ( s ide c hain- c leaving), который локализован во внутренней мембране митохондрий клеток стероидогенных тканей и, с участием двух других компонентов митохондриальной электрон-транспортной цепи, адренодоксина и адренодоксинредуктазы, катализирует реакцию отщепления боковой цепи холестерина с превращением его в прегненолон – общий предшественник всех стероидных гормонов животных. Несмотря на то, что похожий белок в растениях пока не найден, известно, что в растениях рода наперстянка ( Digitalis sp. ), по-видимому, также именно в митохондриях, происходит превращение холестерина в прегненолон (Lindemann & Luckner, 1997).

MATERIALS AND METHODS

Методы получения трансгенных растений с помощью агробактериальной трансформации, использованные нами в данной работе, были подробно описаны в предыдущих публикациях (Kartel et al., 2004; Spivak et al., 2009; Khaliluev et al., 2011).

Тестирование трансгенных растений табака, содержащих кДНК гена CYP 11 A 1 , на устойчивость к грибному фитопатогену Botrytis cinerea проводили по методике, вкратце описанной нами ранее (Kartel et al ., 2004). В качестве тест-культуры использовали фитопатогенный гриб вида Botrytis cinerea, вызывающий серую гниль. В провоцирующих условиях изолированные листья среднего возраста и одного размера помещали в чашки Петри на фильтровальную бумагу, увлажненную водой. По 10 мкл суспензии спор возбудителя, содержащей 2000 спор/мл, наносили в 6 точек на лист, после чего чашки с листьями герметично закрывали для создания повышенной влажности и выдерживали в климатокамере при температуре 24°С и 16-ти часовом световом дне. В качестве контроля использовали листья нетрансформированных растений и растений, содержащих только векторную плазмиду (без кДНК CYP11A1 ). Степень поражения листовых пластинок (обратная величина по отношению к устойчивости растения к Botrytis cinerea ) оценивалась в баллах по количеству и размеру некротических пятен на 10-ые сутки после заражения.

Клонирование кДНК и генов митохондриальных ферредоксинов растений семейства Solanaceae. Для выделения тотальной геномной ДНК из листьев томата, картофеля и наперстянки использовали методику, описанную нами ранее для табака (Kartel et al., 2004), и представляющую собой модифицированную методику Эдвардса с соавторами (Edwards et al., 1991), включающую дополнительную экстракцию фенолом.

Суммарную РНК экстрагировали из замороженных и гомогенизированных в жидком азоте листьев растений с помощью TRIzol-метода (Invitrogen) и очищали с использованием набора Qiagen RNeasy MinElute Cleanup kit (Qiagen). Синтез полноразмерных кДНК проводили по методу SMART (Zhu et al ., 2001), используя систему гнездовых SMART-праймеров с различающимися SfiI-сайтами (на 5’- и 3’-концах кДНК) и Long-Distance ПЦР-амплификацию для синтеза второй цепи и получения двухцепочечной кДНК (Barnes, 1994).

Для биоинформационного поиска последовательностей, предположительно кодирующих близкие по структуре к адренодоксину (АDХ) и адренодоксинредуктазе (ADXR) белки из растений семейств Solanaceae (паслёновые) и Scrophulariaceae (норичниковые), использовали подходы, описанные в монографии по биоинформатике растений из серии Methods in Molecular Biology (Edwards D., Editor, 2007). На основании этих данных были сконструированы наборы маловырожденных праймеров и олигонуклеотидных зондов для поиска интересующих нас последовательностей в описанных выше препаратах геномной и комплементарной ДНК. В частности, для клонирования кДНК томата, картофеля и табака, кодирующих ферредоксины митохондриального типа (MFDX) использовали праймеры oYSH16 (5’-GACGAATTССAAATGGTSGGNTTYCA) и oYSH17 (5’-CAGGATCCTCGAGCTARTGHGGYTTNGG). Молекулярное клонирование полученных ПЦР-фрагментов, отбор и анализ клонов проводили с помощью методов последовательных разведений и/или гибридизации нуклеиновых кислот, описанных нами ранее (Shpakovski & Lebedenko, 1997;

Трансмиссионная электронная микроскопия. Растительным материалом для исследований служили асептические проростки Nicotiana tabacum cv. Petit Havana линии SR1 и полученные на основе этого сорта табака две трансгенные линии (TR-2,    TR-7) поколения     Т4, экспрессирующие кДНК гена CYP11A1 цитохрома P450SCC, выделенную из коры надпочечников быка. Фрагменты срединной части семядолей, полученных от двухнедельных асептических проростков, фиксировали при температуре +4°С в 2,5% растворе глутарового альдегида на 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2) с добавлением 1.5% сахарозы. После отмывки от фиксирующей смеси растительный материал дофиксировали 1.0% раствором четырёхокиси осмия (ОsО4) (Sigma, США), обезвоживали в этаноле повышающейся концентрации (30, 50, 70, 96 и 100%), затем – в окиси пропилена. Образцы заключали в смесь эпоксидных смол Эпона-812 и Аралдита по стандартной методике. Ультратонкие срезы толщиной 30–40 нм получали на ультрамикротоме LKB–V, монтировали на покрытые формваровой подложкой бленды, после чего контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу (Reynolds, 1963). Полученные препараты просматривали на электронном микроскопе H-500 (Hitachi, Япония) при ускоряющем напряжении 75 кВ.

RESULTS AND DISCUSSION

Ранее нами в рамках совместного проекта учёных России и Беларуси были получены и детально охарактеризованы трансгенные растения табака Nicotiana tabacum L. (в качестве удобного модельного объекта), экспрессирующие кДНК СYP11A1 цитохрома P450 SCC из коры надпочечников быка (рис. 1) и обладающие повышенной продуктивностью и устойчивостью к грибным фитопатогенам (Shpakovski et al ., 1992; Kartel et al ., 2004; Kartel et al ., 2007). Изучение четырёх поколений этих трансгенных растений показало, что они по сравнению с растениями дикого типа имеют сокращенный период вегетативного развития, выражающийся прежде всего в раннем цветении и созревании семян (рис. 2), увеличенную биомассу и повышенную продуктивность (количество и качество семян), а также повышенный иммунитет к неспецифическому патогену Паслёновых Botrytis cinerea (рис. 3). В отличии от контрольных растений дикого типа в трансгенных растениях обнаружен прегненолон – продукт реакции, катализируемой цитохромом Р450 SCC (CYP11A1).

Установлено, что содержание прогестерона в листьях трансгенных растений существенно (в несколько раз) выше, чем в листьях растений дикого типа (Spivak et al ., 2009; Spivak et al ., 2010).

Очень важным было определить точное место синтеза прегненолона и прогестерона в полученных нами трансгенных растениях табака. У животных первые этапы синтеза стероидных гормонов (отщепление боковой цепи холестерина с превращением его в прегормон прегненолон, и далее – в прогестерон) происходят в митохондриях, на их внутренней мембране (Miller, 2013). Как отмечалось выше, именно там локализован цитохром P450 SCC (CYP11A1) и именно туда доставляется субстрат холестерин. При этом именно перемещение холестерина с наружной на внутреннюю мембрану митохондрий, осуществляемое с помощью особой, многокомпонентной макромолекулярной машины при активном участии белка StAR ( st eroidogenic a cute r egulatory protein), является скорость-лимитирующей стадией в синтезе стероидных гормонов у животных.

В то же время, по всем имеющимся на сегодняшний день данным синтез брассиностероидов (стероидных гормонов растений) происходит на мембранах эндоплазматического ретикулума или, гораздо реже, на плазматической мембране растительных клеток. Несмотря на то, что цитохромы P450 представляют собой едва ли не самое обширное из всех белковых семейств в протеомах растений

(например, на них приходится ~1% кодирующего потенциала арабидопсиса (Nelson et al ., 2004)), существование митохондриальных цитохромов у растений до сих пор не доказано. Тем не менее, основываясь на данных Лузикова с соавторами (Luzikov et al ., 1994) о том, что незрелый цитохром P450 SCC из коры надпочечников быка импортируется в митохондрии растений, где приобретает размеры зрелой формы, аналогично тому, как это происходит в митохондриях клеток животных, при конструировании экспрессионного растительного вектора мы использовали полноразмерную последовательность кДНК CYP11A1 длиной в 1754 п.о. (рис. 1), кодирующую белок-предшественник P450 SСС из коры надпочечников быка с лидерным N -концевым экстрапептидом (Shpakovski et al ., 1992; Spivak et al ., 2009).

Поскольку уникальный только для животных ключевой фермент стероидогенеза CYP11A1 функционирует в митохондриях вместе с FAD-содержащим флавопротеидом ADXR (адренодоксинредуктазой) и [2Fe-2S]-ферредоксином АDХ (адренодоксином), мы изучили, какие белки выполняют функцию этих партнёров цитохрома Р450 SCC в растениях. В результате, впервые охарактеризованы основные компоненты митохондриальной электронтранс-портной цепи растений: клонированы и установлена структура кДНК и генов адренонодоксиноподобных ферредоксинов табака, томата, картофеля из семейства Solanaceae и наперстянки Digitalis purpurea L.

(семейство Scrophulariaceae). Установлено, что у растений из семейства паслёновых имеются два разных гена ферредоксинов митохондриального типа ( MFDX1 и MFDX2 ), имеющие сходную экзон-интронную структуру (содержат по 8 экзонов) и кодирующие предшественники адренодоксино-подобных белков (204-216 aa), различающиеся прежде всего по структуре N -концевого участка белка (кодируется первым и вторым экзонами), соответствующего лидерному пептиду (рис. 4). Определена первичная структура кДНК и генов, кодирующих белки NADPH-оксидоредуктазы (MFDXR) Nicotiana tabacum L., Solanum lycopersicum L. и Solanum tuberosum L. (485 aa), структурно родственные ADXR животных. Полученные результаты указывают на несомненное сходство электронтранспортных цепей P450-зависимых монооксигеназ в митохондриях животных и растений.

Далее, с помощью электронной микроскопии на ультратонких срезах листьев табака мы показали, что в изучаемых нами трансгенных растениях табака, экспрессирующих кДНК гена CYP11A1, изменяется структурная организация митохондрий: они уменьшаются в размерах, теряют характерную округлую форму (становятся более овальными) и приобретают более плотную, гранулированную консистенцию (рис. 5). Это указывает на то, что перенесённый нами в растения цитохром P450SCC животных, по-видимому, также функционирует именно в митохондриях (накапливаясь в митохондриях растений и даже изменяя их структуру). Эти данные – первое свидетельство того, что начальные этапы синтеза стероидных гормонов могут происходить и в растительных митохондриях. Будет интересно определить все белки-участники этого процесса, в частности истинные партнёры цитохрома P450SCC в клетках растений.

Показанная нами на примере СYP11A1 функциональная совместимость стероидогенных систем Plantae и Animalia, открыла перспективу получать трансгенные растения с комбинированными стероидогенными системами таких интересных с точки зрения сельского хозяйства, практической биотехнологии и/или фармакологии видов, как томат, картофель и наперстянка. Первичные трансгенные растения томата Solanum lycopersicum L. и наперстянки Digitalis purpurea L., экспрессирующие кДНК СYP11A1 цитохрома P450 SCC из коры надпочечников животных, уже получены нами методом агробактериальной трансформации (рис. 6). В настоящее время полученные независимые трансгенные линии растений томата и наперстянки успешно адаптированы к почвенным условиям и выращены в защищенном грунте; для некоторых первичных трансгенных линий томата получены плоды с жизнеспособными семенами (рис. 7).

1      cagct gtgggggcag c ATGC TAGCA AGGGGGCTTC CCCTCCGCTC AGCCCTGGTC

56 AAAGCCTGCC CACCCATCCT GAGCTCAGTG GGGGAGGGCT GGGGCCACCA CAGGGTGGGC

116 ACTGGAGAGG GAGCTGGCAT CTCCACAAAG ACCCCTCGCC CCTACAGTGA GATCCCCTCC 176 CCTGGTGACA ATGGCTGGCT TAACCTCTAC CATTTCTGGA GGGAGAAGGG CTCACAGAGA

236 ATCCACTTTC GCCACATCGA GAACTTCCAG AAGTATGGCC CCATTTACAG GGAGAAGCTT

296 GGCAATTTGG AGTCAGTTTA TATCATTCAC CCTGAAGACG TGGCCCATCT CTTCAAGTTC

356 GAGGGATCCT ACCCAGAGAG ATATGACATC CCGCCCTGGC TGGCCTATCA CCGATATTAT

416 CAGAAACCCA TTGGAGTCCT GTTTAAGAAG TCAGGAACCT GGAAGAAAGA CCGGGTGGTC

476 CTGAACACGG AGGTGATGGC TCCAGAGGCA ATAAAGAACT TCATCCCACT GCTGAATCCA

536 GTGTCTCAGG ACTTCGTCAG CCTCCTGCAC AAGCGCATCA AGCAGCAGGG CTCCGGAAAG

596 TTTGTAGGGG ACATCAAGGA AGACCTGTTT CACTTTGCCT TTGAGTCCAT CACCAATGTC

656 ATGTTTGGGG AGCGCCTGGG GATGCTGGAG GAGACAGTGA ACCCCGAGGC CCAGAAGTTC

716 ATTGATGCCG TCTACAAGAT GTTCCACACC AGTGTCCCTC TGCTCAACGT CCCTCCAGAA

776 CTGTACCGTC TATTCAGAAC CAAGACTTGG AGGGACCATG TAGCCGCATG GGACACAATT

836 TTCAATAAAG CTGAAAAATA CACTGAGATC TTCTACCAGG ACCTGAGACG GAAAACAGAA

896 TTTAGGAATT ACCCAGGCAT CCTCTACTGC CTCCTGAAAA GTGAGAAGAT GCTCTTGGAG

956 GATGTCAAGG CCAATATTAC GGAGATGCTG GCAGGGGGTG TGAACACGAC ATCCATGACA

1016 TTGCAATGGC ACTTGTACGA GATGGCACGC AGCCTGAATG TGCAGGAGAT GCTGCGGGAG

1076 GAGGTTCTGA ATGCCCGACG CCAGGCAGAG GGAGACATAA GCAAGATGCT GCAAATGGTC

1136 CCACTTCTCA AAGCTAGCAT CAAGGAGACG CTGAGACTCC ACCCCATCTC CGTGACCCTG

1196 CAGAGATACC CTGAAAGTGA CTTGGTTCTT CAAGATTACC TGATTCCTGC CAAGACACTG

1256 GTGCAAGTGG CCATCTATGC CATGGGCCGA GACCCTGCCT TCTTCTCCAG TCCGGACAAG

1316 TTTGACCCAA CCAGGTGGCT GAGTAAAGAC AAAGACCTCA TCCACTTCCG GAACCTGGGC

1376 TTTGGCTGGG GAGTGCGGCA GTGCGTGGGC CGGCGGATCG CCGAGCTGGA GATGACCCTC

1436 TTCCTCATCC ACATTCTGGA GAACTTCAAG GTTGAAATGC AGCATATCGG TGACGTGGAC

1496 ACCATATTCA ACCTCATCCT GACGCCGGAC AAGCCCATCT TCCTTGTCTT CCGCCCCTTC

1556 AACCAGGACC CGCCCCAGGC G TGAc cggag agggcgggca ctgccctttc caccaatcca

1616 gctagctggg gtgtgggaag acggcccgag ggggtggggc catggaggta cccgcacctc

1676 cattgctcgc tcagtccaca cctcttgcac ctttctggct aggtctgacc agatgaagct

1736 ggcactcagg ggtcagctg

Рисунок 1. Нуклеотидная последовательность полноразмерной кДНК гена CYP11A1 из коры надпочечников быка, использованная нами при создании рекомбинантных плазмид для её экспрессии в растениях. Подчёркнуты стартовый (ATG) и терминирующий (TGA) кодоны и выделенный помимо этого ещё и жирным шрифтом кодон ATC, кодирующий первую аминокислоту (Ile) зрелого белка – цитохрома P450 SCC .

недели с момента начала плодоношения растений

Рисунок 2. Динамика образования семенных коробочек у трансгенных растений табака поколения Т3. CYPL1–CYPL4 – независимые линии трансгенных растений табака, экспрессирующих кДНК CYP11А1 ; К1 – контрольные растения дикого типа, pG1 – растения, трансформированные вектором, не содержащим кДНК CYP11A1 .

Рисунок 3. Результаты биотеста на устойчивость трансгенных растений табака, экспрессирующих кДНК гена CYP11A1 , к грибному фитопатогену Botrytis cinerea (а – поражение листа). 1 – контрольное нетрансгенное растение (поражение листа в 7 баллов); 2 – растение одной из трансгенных линий (поражение листа в 1 балл).

S1-MFDX1:

MVGFHVRRLAHRLTRSSISALLLHDSASAAHVSLLKVGSRSYNTAAKNRTRDLFPSNCSNATSP CNPGTSYGPLSRYQILLGLGHKEYCTTTGNEEKQTTSVTFVDKDGEEKHIKVPVGMSLLEAAHE NDIELEGACEGSLACSTCHVIVMDVDQYNKLEDPTDEENDMLDLAFGLTETSRLGCQVIAKPEL BGIRVALPAATRNFAVDGFKPKPH (216 aa)

S1-MFDX2:

MVGFQNLRLAHRLTGYVSRSTCELLLKIGCRGYCTEISNRVRNLFPLNYISAPLACIPRTSYTD LLRYSSTQGLRHEQFCTTAGNEEMQKISVTFVDKDGEENHIKVPVGMSMLEAAHENDIELEGAC EASLACSTCHVTVMDMEYYNKLEDPTDEENDMLDLAFALTDTSRLGCQVIAKPELDGTRLALPV ATRNFAVDGYKPKPH (207 aa)

Nt-MFDXl:

MVGFHVLRAARRLARCSLSSLLLRGSPSAFGSFLKVGCRRYNTSTRNRAGVLFPSNSLNALSAC TSETSHYPLSRYHFLQRHEQYCTAAGNEEKQTISVTFVDKBGEEKHIKVPVGMSMLEAAHENDI ELEGACEGSLACSTCHVIVMDVBYYNKLEDPTDEENDMLDLAFGLTETSRLGCQVIAKPELDGL RLALPAATRNFAVDGYEPKPH (213 aa)

Nt-MFDX2:

MVGFHVIRIARRFARCSAFGSFLKVGCRSYNTATRNRAGVLFPSNSLNALLACTSGTSHDPLSR CHFSRVLRHEQYCTTAGNEEKQTISVTFVDKDGEEKHTKVPVGMSMLEAAHENDIELEGACEGS LACSTCHVIVMDVDYYNKLEDPTDEENDMLDLAFGLTETSRLGCQVIAKPELDGLRLALPAATR NFAVEGYKPKPH (204 aa)

St-MFDXl:

MVGFHVRRLAHSLTRSSLSSLLLHDSASAAHVSLLKVGSRSYNTAAKNRIRGLFPSNCSNAISP CTPGTSYGPLSRYQILLGLRHKEYCTTTGSEEKQTISVTFVDKDGEEKHIKVPVGMSLLEAAHE NDIELEGACEGSLACSTCHVIVMDVDQYNKLEDPTDEENDMLDLAFGLTETSRLGCQVIAKPEL BGIRVALPAATRNFAVDGFKPKPH (216 aa)

St-MFDX2:

MVGFHNLRLAHRLTGCSLSSLLLHGSASTCELSLKVGCRSYCTGTSNRVRNLFPLNYISAPLAC IPRTSYTHLLRYSSTQGLRHEQFCTTAGNEGEQKISVTFVBKDGEENHIKVPVGMSMLEAAHEN BIELEGACEASLACSTCHLIVMDMEYYNKLEDPTBEENDMLDLAFALTDTSRLGCQVIAKPELB GIRLALPVATRNFAVDGYKPKPH (215 aa)

Рисунок 4. Аминокислотные последовательности митохондриальных ферредоксинов (MFDX) томата (Sl), картофеля (St) и табака (Nt), выведенные нами из установленных первичных структур впервые клонированных и секвенированных полноразмерных кДНК соответствующих генов. Sl – Solanum lycopersicum , Nt – Nicotiana tabacum , St – Solanum tuberosum .

Рисунок 5. Ультраструктурная организация фрагментов клеток губчатой (А, В, Д) и столбчатой (Б, Г, Е) паренхимы семядольного листа растений дикого типа (А, Б) и трансгенных линий табака TR-2 (В, Г) и TR-7 (Д, Е), экспрессирующих кДНК CYP11A1 цитохрома Р450 SCC из коры надпочечников быка. Обозначения: М – митохондрия, Хл – хлоропласт, В – вакуоль, Я – ядро. Масштабная линейка – 0,5 мкм.

А                                    Б

Рисунок 6. Регенерация растений наперстянки Digitalis purpurea L. на среде, содержащей селективный агент – канамицин. А – экспланты листьев растений исходного (дикого) типа. Б – экспланты листьев растений, подвергнутых агробактериальной генетической трансформации.

Рисунок 7. Плоды со зрелыми семенами первичных трансгенных растений томата Solanum lycopersicum L. (сорт Рекордсмен), экспрессирующих кДНК гена CYP11A1 из коры надпочечников быка (линия 7, растение 2 [трансгенная линия 7-2]).

ACKNOWLEDGMENT

Данная работа осуществлялась в рамках совместного             российско-белорусского исследовательского проекта при финансовой поддержке Российского (РФФИ) и Белорусского республиканского (БРФФИ) фондов фундаментальных исследований.