Митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота как ранний маркер развития системного воспалительного ответа и органной недостаточности у кардиохирургических пациентов

Цитировать: Забелина Т.С., Гребенчиков О.А., Скрипкин Ю.В., Яворовский А.Г., Лихванцев В.В. Митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота как ранний маркер развития системного воспалительного ответа и органной недостаточности в кардиохирургии. Патология кровообращения и кардиохирургия. 2019;23(1):33-41.

Ежегодно в мире выполняется около 7 млн инвазивных кардиохирургических вмешательств [ 1 ]. Несмотря на высокую эффективность и безопасность методов общей анестезии, частота периоперационных осложнений в кардиохирургии достаточно высокая: по свидетельству F. Ji и соавт. [ 2 ], она может достигать 30%, а по данным H. Cheng [ 3 ], даже превышать 60%. Летальность, ассоциированная с развитием периоперационных осложнений при аортокоронарном шунтировании, составляет 2–3% [ 4 ].

Очевидно, прогнозирование и ранняя диагностика периоперационных осложнений могут существенно облегчить процесс их профилактики и лечения или, по крайней мере, уменьшить выраженность вызываемых повреждений. Экспертное сообщество рекомендует с указанной целью проводить исследования уровня тропонина и NT-proBNP в раннем послеоперационном периоде [ 5, 6 ]. Однако данные тесты эффективны только при прогнозировании осложнений сердечно-сосудистой системы, а не в оценке риска системного воспалительного ответа или острого почечного повреждения (ОПП).

Теоретически таким маркером могла бы быть субстанция, появление которой у пациентов после операций на сердце инициирует последовательность событий, приводящих к полиорганной недостаточности. Молекулярные паттерны, связанные с повреждением (англ. Damage-Associated Molecular Patterns, DAMPs), и митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота (мтДНК) рассматриваются как наиболее вероятные биологически активные субстанции [ 7 ]. Повышение концентрации мтДНК наблюдается при множестве патологических состояний: сепсисе [ 8 ], легочной эмболии [ 9 ], раке [ 10 ], атеросклерозе [ 11 ]. Повышение концентрации мтДНК в крови пациентов с травмой является прогностическим маркером, коррелирующим с тяжестью травмы и летальностью [ 12–16 ] .

Гипотеза исследования: митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота является маркером возникновения и интенсивности течения системного воспалительного ответа.

Цель исследования: изучить значимость определения содержания мтДНК в плазме крови кардиохирургических пациентов в раннем послеоперационном периоде для прогнозирования развития системного воспалительного ответа (СВО) и полиорганной недостаточности.

Методы

Общая характеристика больныхи методов исследования

Проведено пилотное проспективное обсервационное когортное исследование взаимосвязи уровня мтДНК в плазме крови и частоты развития СВО, ОПП, острого респираторного дистресс-синдрома и острой сердечной недостаточности у кардиохирургических больных. Исследование получило одобрение этического комитета ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского (протокол № 4, 19.01.2017).

Информированное согласие на участие в исследовании подписали 103 больных, госпитализированных в отделение кардиохирургической реанимации ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, однако, в соответствии с сформулированными ниже критериями, в финальный протокол включены только 85 пациентов (рис. 1).

Критерии включения:

• 1)    возраст 45–65 лет;

• 2)    добровольное информированное согласие;

• 3)    виды оперативных вмешательств: протезирование клапанов сердца; аортокоронарное шунтирование с искусственным кровообращением; аортокоронарное шунтирование без искусственного кровообращения.

Критерии невключения:

• 1)    морбидное ожирение с индексом массы тела более 35 кг/м²;

• 2)    инфаркт или инсульт в предшествующие 6 мес.;

• 3)    инфекционное заболевание за месяц до операции;

• 4)    почечная недостаточность в анамнезе (исходный уровень креатинина или мочевины в крови выше референсных значений);

• 5)    фракция изгнания левого желудочка менее 30%.

Критерии исключения: повторная операция или чрескожное коронарное вмешательство в течение 30 дней после первой операции.

Пациентов разделили на три группы: протезирование клапанов сердца в условиях искусственного кровообращения; аортокоронарное шунтирование без искусственного кровообращения; аортокоронарное шунтирование в условиях искусственного кровообращения.

Рис. 1. Схема отбора пациентов

Подготовка, выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты из плазмы крови

На периоперационном периоде у пациентов забирали 3 мл периферической венозной крови. Кровь, смешанную с этилендиаминтетраук-сусной кислотой (1,5 мг/мл), центрифугировали в течение 10 мин при 3 000 g. Отобранную плазму дополнительно центрифугировали 10 мин при 10 000 g. Верхнюю порцию плазмы помещали в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл и замораживали при –20 °С до выделения ДНК. Для контроля эффективности выделения в каждый образец плазмы объемом 0,4 мл перед процедурой выделения вносили по 10 мкл (1,7 нг/мкл) экзогенной контрольной ДНК на основе плазмиды pBlueScriptSKII(–) размером 8 кб.

Выделение ДНК из 100 мкл плазмы крови выполняли с помощью набора Quick'gDNA Blood MiniPrep (Zymo Research, США) по протоколу производителя. Количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени проводили в амплификаторе iCycler (Bio'Rad, США) со смесью следующего состава: 5 мкл анализируемого образца; 10 мкл смеси Б Eva Green («Синтол», Россия); 0,5 мкл смеси каждого из специфичных праймеров (10 мкМ); 9,5 мкл деионизованной воды. Каждый образец ДНК использовали в качестве матрицы в трех идентичных полимеразных цепных реакциях. Относительное содержание мтДНК определяли с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени [16].

Уровень мтДНК в крови определяли на следующих этапах:

• 1)    мтДНК1 (базовое значение) — уровень мтДНК в крови после индукции анестезии;

• 2)    мтДНК2 — уровень мтДНК в крови после окончания операции;

• 3)    мтДНК3 — уровень мтДНК в крови через 12 ч после операции;

• 4)    мтДНК4 — уровень мтДНК в крови через 72 ч после операции.

Диагностика исследуемых осложнений

Системный воспалительный ответ определен как наличие двух и более критериев, предложенных American College of Chest Physicians / Society of Critical Care Medicine: температура более 38 или менее 36 °C; частота сердечных сокращений более 90 уд./мин; частота дыхательных движений более 20 в мин или pCO₂ менее 32 мм рт. ст.; лейкоцитоз более 12 000 или лейкопения менее 4 000 [ 17 ].

Острое почечное повреждение по критериям RIFLE [18] определено как увеличение сывороточного содержания креатинина в 1,5 раза и более, или снижение скорости клубочковой фильтрации на 25% и более, или снижение темпа мочевыделения менее 0,5 мл/кг × ч в течение 6 ч и более.

Острая сердечная недостаточность определена как потребность в инфузии инотропных препаратов (адреналин, добутамин) в дозе, эквивалентной 5 мкг/кг × мин добутамина или более на протяжении не менее 6 ч после операции.

Шкала вазопрессорно-инотропной поддержки

Суммарную дозу инотропных препаратов и вазопрессоров рассчитывали по формуле: добутамин (мкг/кг × мин) + допамин (мкг/кг × мин) + 100 × адреналин (мкг/кг × мин) [ 19 ]. Острый респираторный дистресс-синдром определялся как наличие очаговых изменений в легочной ткани, возникших в течение недели после хирургического вмешательства и не связанных с задержкой жидкости, а также по степени снижения индекса оксигенации (PaO₂/FiO₂) [ 20 ].

Статистический анализ

Количественные параметры предварительно анализировались на нормальность распределения тестами Лиллиефорса и Шапиро – Уилка. Для сравнения количественных величин, не имеющих нормального распределения, применялся U-критерий Манна – Уитни.

Для оценки качества предикторов клинических исходов операции использовались логистическая регрессия и ROC-анализ. В логистической регрессии применяли статистику хи-квадрат (разность между функциями правдоподобия нулевой и полной моделей, свидетельствующая о том, насколько значимо независимые переменные модели влияют на зависимую). При ROC-анализе оценивался параметр AUC и определялась точка отсечения по соотношению чувствительности (Se) и специфичности (Sp) критериев: требование баланса между чувствительностью и специфичностью:

Se ~ Sp: Cut off= min |Se – Sp|, где Cut off — пороговое значение, Se — чувствительность, Sp — специфичность.

Для анализа динамики показателей с ненормальным распределением применялся ранговый дисперсионный анализ по Фридману с апостериорным анализом с использованием непараметрического теста Уилкоксона. Средние значения нормально распределенных количественных параметров представлены средним арифметическим со стандартным отклонением (M ± Ϭ ), а ненормально распределенных — медианой с межквартильным интервалом (Me [25–75%]).

Различия принимались статистически значимыми при уровне р<0,05. Для расчетов использовались программы Statistica 10.0 (StatSoft, Inc.) и MedCalc 12.5.0.0 (MedCalc Software bvba). Вводили данные (ко- личество позитивных и негативных исходов в каждой группе (уровень ДНК выше или ниже избранного критерия)) в программу MedCalc, рассчитывающую отношение шансов и 95% доверительный интервал.

Результаты

Общая характеристика больных, включенных в исследование, представлена ниже.

Пациентов, n85

Возраст, лет                                   61 ± 9

Фракция выброса, %                        58 ± 10

Пол, мужской/женский, n60/25

Операция на клапанах, n24

Аортокоронарное шунтирование без искусственного кровообращения, n

Аортокоронарное шунтирование с искус- ственным кровообращением, n

Примечание. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение

Базовое значение мтДНК в объединенной популяции больных составило 0,21 [0,15–0,31] нг/мл. К окончанию операции на сердце исследуемый показатель возрос в 3,5 раза, р<0,01. Через 12 ч после операции рост продолжался, уровень мтДНК превысил исходные значения в 4,3 раза (p<0,01). К исходу третьих суток после операции наметилась тенденция к снижению искомого показателя, хотя мтДНК превышала базовый уровень почти в 2 раза, р<0,01. Динамика уровня мтДНК в крови на этапах периоперационного периода в объединенной когорте пациентов представлена ниже.

Митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота в крови	Медиана
1 нг/мл	0,21 [0,15–0,31]
2 нг/мл	0,73 [0,33–0,88]
3 нг/мл	0,91 [0,57–1,00]
4 нг/мл	0,40 [0,23–0,55]

Таким образом, динамика уровня мтДНК подтверждает предположение, что массивный клеточный цитолиз, как следствие выполнения обширных и травматичных операций на сердце, приводит к высвобождению изучаемой субстанции.

Уровень мтДНК в исходе не имел статистически значимых отличий при сравнении подгрупп пациентов, которым выполнены протезирование клапанов

Рис. 2. Митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота в крови пациентов на этапах исследования

Примечание. Данные представлены в виде медианы. I — межквартильный интервал; * значимое отличие относительно исхода, p<0,05; АКШ — аортокоронарное шунтирование; ИК — искусственное кровообращение

сердца и аортокоронарное шунтирование (АКШ) в условиях искусственного кровообращения или без него (рис. 2).

Далее во всех подгруппах наблюдалась сходная с описанной для общей совокупности пациентов динамика содержания мтДНК. Полное отсутствие статистически значимых межгрупповых отличий на всех выделенных этапах исследования (рис. 2) позволило провести дальнейший анализ без учета подгрупп, в которые попадал каждый из пациентов.

Системный воспалительный ответ в раннем послеоперационном периоде развился у 55% пациентов после операций на клапанах сердца, у 38% пациентов после АКШ без ИК и у 45% пациентов после АКШ с ИК, разница статистически не значима, р>0,1. Средняя частота развития СВО в когорте — 46%.

Митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота, измеренная после окончания операции, показала потенциальную возможность прогнозирования СВО в течение 1–2 сут. послеоперационного периода (площадь под кривой AUC = 0,74). При определении точки cut-off обнаружено, что митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота более 0,54 нг/мл с чувствительностью 73,7% и специфичностью 66% свидетельствует о системном воспалительном ответе в раннем послеоперационном периоде.

Митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота, измеренная через 12 ч после операции, показала прогностический уровень (площадь под кривой AUC = 0,86) в отношении риска СВО в течение 1–2 сут. послеоперационного периода. При определении точки cut-off найдено, что митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота более 0,98 нг/мл с чувствительностью 67,6% и специфичностью 94% доказывает развитие СВО в раннем послеоперационном периоде (рис. 3).

Как и предполагалось, чувствительность и специфичность теста с определением мтДНК для прогнозирования развития СВО увеличивались на третьем этапе исследования. Однако было принципиально выяснить, что и анализ, взятый у пациентов непосредственно после окончания операции, показал прогностические возможности метода.

Острое почечное повреждение развилось у 37% пациентов после операций на клапанах сердца, у 21% пациентов после АКШ без ИК и у 25% пациентов после АКШ с ИК, разница не значима, р>0,1. Средняя частота развития ОПП в когорте — 27%.

По времени возникновения ОПП пациенты распределились следующим образом: сразу после окончания операции у 2 (3%) больных; к исходу первых мтДНК2

мтДНК3

Специфичность

Специфичность

Рис. 3. ROC-кривые для прогнозирования риска системного воспалительного ответа в зависимости от уровня митохондриальной дезоксирибонуклеиновой кислоты в крови

Примечание. мтДНК2 — митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота после операции, мтДНК3 — митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота через 12 ч после операции суток — у 8 (12%); на вторые сутки еще у 8 (12%) и, наконец, на третьи сутки — у 3 (4%) больных.

Соотношение шансов получить ОПП у пациентов с СВО и без него составило 3,4 [1,27–9,08], p = 0,0149. Таким образом, подтверждается гипотеза о связи СВО и возникновения острой почечной недостаточности.

Сердечная недостаточность зарегистрирована у 58% пациентов после операций на клапанах сердца, у 21% пациентов после АКШ без ИК и у 43% после АКШ с ИК соответственно, р = 0,08. Средняя частота развития сердечной недостаточности в когорте — 40%. Соотношение шансов получить сердечную недостаточность для пациентов с СВО и без него — 5,7 [2,20–14,84], р = 0,0003.

Острый респираторный дистресс-синдром зарегистрирован у 15% пациентов после операций на клапанах сердца, у 16% пациентов после АКШ без ИК и у 21% после АКШ с ИК соответственно, р>0,05. Средняя частота развития острого респираторного дистресс-синдрома в когорте — 17%. Соотношение шансов получить острый респираторный дистресс-синдром для пациентов с СВО и без него — 3,6 [1,01–11,10], р = 0,047.

Обсуждение

Впервые показано, что определение уровня мтДНК в пробе плазмы крови кардиохирургических пациен- тов, взятой непосредственно после операции, является достаточно точным и надежным предиктором системного воспалительного ответа, острой сердечной, почечной недостаточности и острого респираторного дистресс-синдрома.

Установлено, что мтДНК повышается сразу после окончания операции, достигает пика через 12 ч после вмешательства и снижается к концу 4-х сут. послеоперационного периода.

Ранее C. Qin и соавт. [ 21 ] получили похожий результат. Они выявили взаимосвязь между уровнем мтДНК и уровнем воспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли, интерлейкин-6, интерлейкин-8, у кардиохирургических пациентов.

В нашем исследовании на каждом этапе уровень мтДНК в большей степени определяется оперативным вмешательством, чем видом оперативного вмешательства. Более того, малосущественным оказалось и то, используется ли искусственное кровообращение в процессе проведения операции. Таким образом, становится понятным, почему не наблюдается существенных отличий в клинических исходах после АКШ, выполняемого в режиме искусственного кровообращения и без него [ 22 ].

Тест с определением мтДНК продемонстрировал прогностические возможности развития СВО. По соотношению чувствительность/специфичность дан- ный метод не уступает прокальциотониновому тесту [23], но, по-видимому, превосходит по временным характеристикам. Насколько известно, для прокальцитонина не описана возможность прогнозирования СВО по пробе, взятой сразу после операции [24].

Системный воспалительный ответ играет важную роль в процессе возникновения ОПП после кардиохирургических операций [ 25, 26 ] . Данное положение подтверждено и в ходе исследования. Более того, мы показали, что СВО играет важную роль и в процессе развития острой сердечной недостаточности, ОПП и острого респираторного дистресс-синдрома в ранние сроки после кардиохирургических вмешательств.

Международные рекомендации требуют исследования уровня тропонина и NT-proBNP в раннем послеоперационном периоде для прогнозирования возможных осложнений со стороны сердечно-сосудистой системы [ 5, 6 ]. Согласно указанным рекомендациям, увеличение уровня NT-proBNP, определяемое в крови больных сразу после операций, повышает риск острой сердечной недостаточности в 3,5 раза. В соответствии с полученными результатами, тест с определением мтДНК прогностически более значим, чем NT-proBNP и тропонин.

Ранее показано, что повышение концентрации мтДНК в крови пациентов с травмой может являться прогностическим маркером, коррелирующим с тяжестью травмы и летальностью [ 12–16 ] . Аналогичных исследований в отношении периоперационного периода плановых хирургических вмешательств не проводилось.

Ограничения

Работа выполнена в форме пилотного исследования с ограниченной выборкой. Возможно, именно поэтому не удалось выявить межгрупповых отличий в содержании мтДНК в крови пациентов после АКШ и протезирования клапанов сердца.

Заключение о преимуществе во времени перед тестом с определением прокальцитонина носит гипотетический характер, отсутствие возможности проведения количественного анализа прокальцитонина не позволило сделать сравнение в рамках проведенного исследования.

Заключение

В результате исследования выявлена взаимосвязь между уровнем мтДНК, определенным сразу после окончания операции, и частотой развития СВО. Повышенный уровень мтДНК является ранним предиктором острой сердечной и почечной недостаточности и острого респираторного дистресс-синдрома в раннем послеоперационном периоде у кардиохирургических больных.

Финансирование

Работа выполнена в рамках бюджетного финансирования ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского по теме НИР 1.6 «Оксидантный стресс в кардиохирургии: новые маркеры — предикторы развития осложнений и патогенетически обоснованная терапия».