Многофункциональная аналитическая система для определения характеристик оптического сигнала кругового дихроизма биологически активного материала

ВВЕДЕНИЕ                    биотиков) также приводит к появлению в спектре

В настоящее время линейка аналитических систем на основе портативного дихрометра с использованием ДНК-биодатчиков разного типа — "жидких" частиц холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК, наноконструкций (НаК) ДНК, в которых молекулы ДНК упорядочены и сшиты между собой различными наномостиками, иммобилизованных в геле НаК ДНК и т. п. [1, 2] — достаточна обширна. Для биодатчиков на основе НаК ДНК характерна не только аномальная оптическая активность, проявляемая в виде интенсивной полосы в спектре кругового дихроизма (КД) в области поглощения азотистых оснований ДНК на длине волны ~260–270 нм, но и дополнительная аномальная оптическая активность в области поглощения элементов наномостиков, "сшивающих" НаК ДНК, в частности хромофоров антибиотиков в области длин волн 450–650 нм, например дауномицина в области 505–525 нм. Величина аномальной оптической активности таких биодатчиков в полосе поглощения антибиотика остается неизменной в течение длительного времени и может уменьшаться (вплоть до полного исчезновения) под действием биологически активных веществ (БАВ), "мишенью" для которых служат структурные элементы наномостиков, являющиеся по сути наносенсорами. Встраивание (интеркаляция) в структуру "жидких" частиц холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК биологически активных соединений (например, противоопухолевых анти-

кругового дихроизма дополнительной аномальной полосы в видимой области спектра, амплитуда которой зависит от концентрации указанных соединений и используется для установления в анализируемой жидкой среде их наличия и концентрации.

Задача исследования оптических свойств и контроля качества биодатчика на основе НаК ДНК, а также изменения этих свойств при взаимодействии с БАВ обычно решается с использованием дихрометров, имеющих в своем составе ламповый источник излучения и монохроматор и работающих в широком диапазоне длин волн со слабыми световыми потоками, что, конечно, ограничивает чувствительность регистрации сигнала КД и точность определения концентрации определяемых БАВ в анализируемых пробах.

Опыт использования в составе оптической биосенсорной аналитической системы компактного дихрометра для определения дауномицина в жидкости, работающего на двух дискретных рабочих длинах волн [3, 4], позволил говорить о возможности реализации многофункциональной аналитической системы, которая содержала бы размещенный на вращающемся диске турели достаточно большой набор высокояркостных интенсивных светодиодных источников излучения, снабженных коллимирующими линзами и узкополосными интерференционными фильтрами, вместе формирующих достаточное количество узкополосных излучающих комплексов и обеспечивающих

Рис. 1. Принцип работы многофункциональной аналитической системы для определения характеристик оптического сигнала кругового дихроизма биологически активного материала (для наглядности диск турели показан вращающимся в вертикальной плоскости)

функционирование системы в нескольких режимах [5] (рис. 1). Компоновка системы может быть еще более компактной и устойчивой, если диск турели вращается в горизонтальной плоскости и используется уголковый отражатель для изменения направления световых лучей. Съемная кювета с жидкими пробами размещается вертикально в приемном устройстве; для размещения исследуемого гелевого или пленочного образца используется перемещаемая микроплата с лунками (с оптически проницаемым для излучения дном). Выбор режима работы системы (каждого ее элемента и системы в целом) и подачу управляющих команд осуществляет встроенный микрокомпьютер.

При сравнении с существующими аналитическими системами, работающими на принципах измерения КД, такая "многолучевая" система по- тенциально обладает более высокой чувствительностью регистрации сигнала КД и точностью определения концентрации БАВ в анализируемых пробах, в том числе ультранизкой концентрации (до ~10 моль/мл).

ОПИСАНИЕ РЕЖИМОВ РАБОТЫ МНОГОФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АНАЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

Режим тестирования системы в УФ и видимом диапазонах осуществляется при размещении в приемном устройстве оптически проницаемой съемной кюветы с размещенной в ней тестовой пробой, содержащей эталон оптической активности. В качестве такого эталона может быть использован в том числе и сам биологически

Рис. 2. Пример определения характеристик КД биологически активного материала, выполненного в виде интегрального биодатчика, содержащего "сшитые" мостиками наноконструкции ДНК в водно-солевом растворе полиэтиленгликоля при облучении в ультрафиолетовом и видимом диапазонах с изменением величины максимума сигналов КД в видимой области спектра в сторону ее уменьшения при взаимодействии с биологически активным веществом (кривая 6)

активный материал в виде жидкокристаллического ДНК-биодатчика, откалиброванный по первичному эталону. По результату регистрации спектра КД делается вывод о работоспособности системы выявлять и регистрировать сигналы КД исследуемых проб, вычислять их характеристики и визуализировать их с достаточной степенью достоверности.

Процесс измерений осуществляется путем подачи системой управления команды включения последовательно источников излучения и команд поворота диска турели, достаточного для последовательного формирования излучающих комплексов. Например, измерение величины аномального оптического сигнала КД биологически активного материала (БАМ) биодатчика на основе "сшитых" мостиками НаК ДНК в исходном состоянии производится при облучении биодатчика в видимой области спектра с максимумом Δ А Vmax на длине волны λ 11 = 505 нм и при облучении в УФ-области с максимумом Δ А UVmax на длине волны λ 6 = 260 нм (рис. 2). Данные измерений служат паспортом биодатчика в исходном состоянии. Последующее добавление в исследуемую пробу известного БАВ может привести к частичному или полному разрушению БАМ или показать инертность БАМ к БАВ. Исчезновение сигнала КД БАМ в ультрафиолетовой области спектра позволяет определить количество БАВ, приводящее к полному разрушению структуры БАМ.

Режим определения скорости диффузии БАВ в БАМ и/или исследования динамики трансформации наноконструкций ДНК при взаимодействии с БАВ реализуется после тестирования БАМ в контакте с известной концентрацией БАВ и определения длин волн, на которых оптическая активность КД биодатчика в исходном состоянии максимальна. В этом режиме обеспечиваются работа излучающих комплексов на характерных длинах волн КД биодатчика в течение заданного времени экспозиции, измерение величины максимальной амплитуды Δ A сигнала КД биодатчика до контакта с БАВ и после полного проникновения БАВ в молекулярные структуры биодатчика, при этом фиксируется время прекращения взаимодействия биодатчика с БАВ по моменту прекращения изменения амплитуды сигнала КД пробы.

Заметим, что система позволяет время определения скорости диффузии БАВ в биодатчик существенно сократить за счет проведения измерений величины КД БАМ, обработанных раствором БАВ, через небольшие одинаковые интервалы времени Δ Т , достаточные для проявления характерной зависимости изменения аномального сигнала КД биодатчика во времени при взаимодействии БАВ с чувствительными элементами биодатчика, т. е. не дожидаясь осуществления полной диффузии БАВ в биоматериал. На рис. 3 в виде кривых 15, 16 и 17 представлена динамика изменения амплитуды сигнала КД через равные

Рис. 3. Динамика изменения амплитуды сигнала КД через равные интервалы времени в течение 80 мин взаимодействия биодатчика с водным раствором белка сывороточного альбумина (БСА) в различных концентрациях.

Концентрация БСА: 1.1 мкг/мл — кривая 15, 3.4 мкг/мл — кривая 16 и 5.7 мкг/мл — кривая 17

интервалы времени в течение 80 мин взаимодействия биодатчика с водным раствором белка сывороточного альбумина (БСА) в различных концентрациях.

Режим калибровки оптических свойств биологически активного материала — это стандартная процедура регистрации величины сигналов КД биодатчика на характерных для него длинах волн в течение заданного времени экспозиции в нескольких пробах, соответствующих разным концентрациям взаимодействующего с биодатчиком БАВ, в том числе до контакта с БАВ.

Облучение проб производится как минимум на трех длинах волн — соответствующей максимуму сигнала КД биодатчика в исходном состоянии и на длинах волн (большей и меньшей первой), соответствующих минимальным значениям сигнала КД биодатчика в исходном состоянии (для учета фонового уровня сигнала КД). Например, для случая биодатчика с мостиковыми "сшивками" ДНК величина максимума сигнала в спектре КД в области поглощения ДАУ (элемент мостика) на длине волны λ = 505 нм изменяется в связи с разрушением мостиков "сшивки" при взаимодействии биодатчика в калибровочных пробах с водным раствором БСА на уровне концентрации в несколько мкг/мл.

Величины изменения максимума амплитуды сигналов Δ А max на указанной выше длине волны для заданных одинаковых промежутков времени и для каждой из исследуемых проб с разной концентрацией БАВ, рассчитанные с учетом фоновых сигналов, сохраняются в памяти компьютера, где

Рис. 4. Калибровочные зависимости относительного изменения максимума амплитуды сигнала КД БАМ, выполненного в виде биодатчика, содержащего молекулы ДНК в упорядоченном состоянии, сшитые "мостиками" комплексов "ДАУ-Cu", после обработки водным раствором белка (БСА) в известной концентрации в течение 10 мин (кривая 21) и после обработки водным раствором белка в известной концентрации в течение 60 мин (кривая 22)

затем соотносятся с величинами результирующих сигналов КД всех исходных проб биодатчика, в результате чего формируются зависимости величины ΔΔ А = Δ А / Δ А max относительного изменения амплитуды сигнала КД, соответствующие времени обработки биодатчика биологически активным веществом.

Полученная зависимость между относительным изменением относительной амплитуды ΔΔ А полосы в спектре КД биодатчика и концентрацией БАВ в растворе в интервале изменений его концентрации может быть использована в качестве калибровочной прямой при определении концентрации БАВ в растворах с помощью биодатчика. Таким образом были получены, например, калибровочные зависимости для определения наличия и содержания белка сывороточного альбумина (рис. 4) и гипорамина в исследуемых пробах, предположительно содержащих указанные БАВ в неизвестной концентрации. Полученная аналитическая калибровочная зависимость для миток-сантрона в широкой области концентраций, в том числе в области концентраций до 10 ^–9 моль/мл, позволяет осуществить его определение с более высокой (в 2–3 раза) точностью и воспроизводимостью по сравнению с аналитической калибровочной кривой, полученной с помощью дихромет-ра-прототипа. Калибровочные данные сохраняются в памяти компьютера для последующего использования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Резюмируя, можно сказать, что представляемая многофункциональная аналитическая система при сравнении ее с существующими аналитическими системами обладает более высокой чувствительностью при исследовании оптических свойств и контроле качества биодатчиков на основе ДНК, при измерении оптической активности, определении наличия и концентрации практически важных классов БАВ в жидкости, а также обладает дополнительными функциональными возможностями, в частности при использовании в качестве оптического диффузометра при анализе механизмов транспорта БАВ, разрушающих биодатчик, и определении их коэффициентов диффузии в БАМ. В силу этих возможностей такая система может с успехом использоваться, например, в лабораториях медицинских учреждений для оперативного мониторинга низких содержаний противоопухолевых антибиотиков в биологической жидкости и принятия своевременного решения в лечебнодиагностическом процессе.