Многомерная биология как основа персонализированной медицины и медицины XXI века

DOI:

В современное время всю большую актуальность приобретает распространение таких заболеваний как сахарный диабет, онкологические заболевания, метаболический синдром, атеросклероз, ишемические болезни сердца, ожирение и пр. Персонализированная медицина, как интегральная медицина, включающая в себя тестирование человека на предрасположенность к различным забо-

леваниям на основе геномных данных, разработку персонализированных средств лечения, является основным инструментом в борьбе с перечисленными выше заболеваниями цивилизации [7].

Целью персонализированной медицины является подбор лекарственного препарата для конкретного пациента, даже если при этом необходима разработка персональной схемы лечения с учетом его индивидуальных данных, что обусловлено тем, что классические схема лечения различных заболеваний все чаще оказываются неэффективными ввиду проявлений побочных эффектов [7; 10].

Основными подходами медицины XXI в. являются [5; 12; 14]:

– переход от классической клинической диагностики к персонализированной;

– тестирование человека на предрасположенность к различным заболеваниям на геномном уровне;

– подбор индивидуальных лекарственных препаратов и схемы лечения, его мониторинг, путем использования биомаркеров.

OMICS (gemomics, transcriptomics, proteomics, metabolomics) – основа персонализированной медицины [2].

Геномика представляет собой идентификацию всех генов человека и нарушений в них, приводящих либо к наследственным заболеваниям, либо к предрасположенности к ним. Расшифровка генома человека, которая позволила получать информацию об особенностях конкретного человека, а, значит, и информацию о характере возникновению и течения заболевания, реакцию организма на различные лекарственные препараты и методы лечения, сыграла решающую роль в создании персонализированной медицины [2; 9].

Ранее исследования отдельных генов и локусов также создали существенные предпосылки для персонализации. Для оценки значимости обнаруживаемых индивидуальных единичных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) в анализируемых генах проводят исследования сравнения частоты их встречаемости между здоровыми лицами и группами больных. Предсказательную информативность обнаруживаемых SNP оценивают по коэффициенту риска (odds ratio, OR), указывающему, во сколько раз чаще данный маркер встречается у больных, чем в популяции в целом. Установлено более 2400 SNP, статистически достоверно ассоциированных с заболеваниями с высокими OR [8; 13].

Наибольшее число работ по определению персонализированных геномных характеристик связано с онкологией. Отмечается, что геномный «молекулярный профиль» биоптата опухоли является уникальной характеристикой опухоли конкретного больного. Специфичные для онкологических заболеваний мутации подробно охарактеризованы в геномном атласе рака (Cancer Genome Atlas), создававшемся в течение 10 лет и потребовавшем более 1 млрд долларов затрат [11]. Одним из первых применений геномики в онкологии была работа по анализу SNP для уточнения классификации отдельных видов лейкозов у больных, способствующая выбору индивидуальной терапии для больных с внешне близкими клиническими признаками болезни. В настоящее время рядом компаний коммерциализованы тесты для выявления предрасположенности к ряду заболеваний, в особенности онкологических [2; 11].

Развитие геномики позволяет, однако, не только проводить молекулярно-генетическую диагностику, но и, как следующий этап, определять интенсивность синтеза РНК и белков, имеющих отношение к возникновению и развитию заболеваний [6].

Транскриптомика представляет собой идентификацию всех матричных РНК, кодирующих белки, определение количества каждой индивидуальной мРНК, определение закономерностей экспрессии всех генов, кодирующих белки [5].

Определение интенсивности синтеза РНК и белков, имеющих отношение к возникновению и развитию заболеваний, происходит с помощью транскрипционных профилей, характеризующих экспрессию всех генов, активных в данном образце. Технологии, применяемые для решения этих задач, основаны на так называемых «ДНК микрочипах» (DNA microarray). Генный чип представляет собой твердую подложку, на которую в определенном порядке нанесены в виде точек индивидуальные гены (их ДНК). Чтобы определить, транскрибируется ли данный ген, на чип помещают (с определенными координатами) лишь его часть – олигонуклеотид. Этот олигонуклеотид соответствует экспрессируемой части гена (экзону). Затем из образца (например, опухоль) выделяется вся (суммарная) РНК. На основе всех молекул РНК данного образца получают их ДНК-копии – кДНК (обратная транскрипция), которые флуоресцентно метят и потом проводят гибридизацию с иммобилизованными на микрочипе олигонук- леотидами [14]. Если в данных условиях какие-то точки с конкретными генами не гибри-дизуются – это значит, что данный ген не транскрибируется. Если же данная точка микрочипа «светится», значит олигонуклеотиды на этой площадке прогибридизовались с флуоресцентно меченой кДНК, ген транскрибируется [8].

Чтобы определить, является ли полученный результат ошибкой или нет, проводится сравнение двух объектов. Для этого берут образец А (патология), из него получают суммарную РНК и после обратной транскрипции всех ее молекул флуоресцентно метят определенным цветом (красным) все молекулы кДНК. То же проводят и с образцом В (норма), но метят молекулы кДНК другим цветом (зеленым). Затем проводят гибридизацию ДНК-микрочипа со смесью этих двух препаратов кДНК (конкурентная гибридизация – преимущественно образуют гибриды те молекулы, которых больше). Если сигнал в данной точке на чипе будет красным, значит в клетках А (патология) транскрипция данного гена сильней, чем в клетках В (норма). Если сигнал зеленый, то транскрипция сильнее в клетках В (норма). Если красного и зеленого поровну, то получится желтый цвет. Таким образом, можно сравнивать уровень транскрипции данного гена в разных тканях и органах, в биологических жидкостях при норме и патологии, до терапии и в ее процессе, до хирургической операции и после. Довольно часто термины «геномика», «транскриптомика» и «протеомика» употребляются в одном и том же значении – для обозначения анализа экспрессии всех генов данного образца – как на уровне синтеза мРНК, так и на уровне синтеза белков.

Транскриптом – набор всех РНК, находящихся в данном образце. Анализ транскрип-тома, определение качественного и количественного профиля всех синтезированных РНК, отражает синтез кодируемых ими белков, а также синтез рибосомальных, транспортных и других РНК. Сравнение транскрипто-мов нормальных и патологических образцов, позволяет идентифицировать новые маркеры, прослеживать изменение их уровней во времени, судить о динамике патологии, об эффективности проводимого лечения и прогнозиро- вать его результат [6; 8]. Предполагается, что каждая болезнь, характеризуется своим, так сказать, «штрих-кодом» – уникальным паттерном уровней транскрипции набора генов, характерного именно для данной болезни. Анализ транскриптом осуществляют с помощью компьютерных методов распознавания образов.

Протеомика представляет собой идентификацию и количественное определение всех индивидуальных белков, которые содержатся в биологическом материале (сыворотка крови, спинномозговая жидкость, моча, биопсия) и мониторинг изменения их концентраций. Протеом – совокупность всех белков, содержащихся в данном образце. Полный анализ протеома клеток, тканей, органов и биологических жидкостей проводится с помощью двумерного электрофореза с высоким разрешением и с последующей идентификацией индивидуальных белков за счет масс-спектрометрии. Это позволяет проанализировать до 10 000 индивидуальных белков в одном образце и зафиксировать изменения их концентраций. Типичная последовательность операций при протеомике такова:

• –    отбор образца (клетки, ткань, биологическая жидкость);

• –    приготовление образца (лизис клеток, экстракция белков);

• –    изоэлектрофокусировка, электрофорез в 1-ом направлении;

• –    электрофорез во втором направлении (полиакриламидный гель, додецилсульфат натрия);

• –    проявление белковых пятен на геле;

• –    анализ двумерной электрофореграммы (количество пятен, их расположение);

• –    выделение участков геля, содержащих индивидуальные белковые пятна;

• –    расщепление индивидуальных белков трипсином прямо в геле;

• –    масс-спектрометрический анализ: масс-фингерпринтинг пептидов и/или определение аминокислотных последовательностей фрагментов индивидуальных белков;

• –    идентификация каждого белка и измерение его концентрации, документирование, обработка результатов [7].

Значительному прогрессу в области протеомики способствовали успехи масс-спектро- метрического анализа пептидов. Масс-спектрометрия включает в себя четыре основных компонента. Во-первых, в ионном источнике масс-спектрометра из образца получают ионизированные пептиды или белки. Во-вторых, разделение ионов пептидов и белков происходит в анализаторе масс на основе их величины отношения массы к заряду (m/z). В-третьих, детектор ионов (время пролетного масс-спектрометра), регистрирует отдельные ионы, с указанием значения m/z иона, количества ионов, и времени пролета ионов от источника ионов до детектора ионов. И, наконец, интерпретация полученных данных с помощью биоинформатики, анализ баз данных, в итоге, получение дифференциального профиля белков [5; 6]. С помощью этой технологии уже открыты новые белковые маркеры и получены впечатляющие результаты в области кардиоваскулярной протеомики и онкопротеомики.

Протеомика тромбоцитов – быстро развивающееся направление. Уже обнаружены ранее неизвестные белки тромбоцитов, быстро идет расшифровка механизмов, приводящих к нарушениям коагуляции. В ранних исследованиях протеомов тромбоцитов было обнаружено, что при активации они секретируют 82 белка. Примерно 35 % белков, сек-ретирируемых тромбоцитами, синтезируются и другими клетками. Только 28 % белков, секретирируемых тромбоцитами, обнаруживаются в местах атеросклеротических повреждений. Эти работы привели к идентификации новых мишеней для новых лекарственных препаратов, таких как секретогранин III, циклофилин А, калуменин, а также пролили свет на возможные механизмы адгезии тромбоцитов, способствующие развитию атеросклероза [4].

Метаболомика представляет собой идентификацию и количественное определение всех метаболитов, синтезируемых (или находящихся) в данных клетках, тканях, органах и в биологических жидкостях [3]. Основное направление работ – выявление метаболических изменений, характерных для инициации патологий и ее динамики, для закономерностей ответа метаболизма на терапию. Основные патологии, находящиеся в фокусе метаболомики – метаболический синдром, сахарный диабет, сердечно-сосудистые заболе- вания, патология печени. Метаболомика основана на применении спектроскопии протонного ядерного магнитного резонанса в сочетании с компьютерным анализом распознавания образов. Распознавание образов мультиплетной структуры спектров ЯМР – это новый инструмент изучения структуры и свойств органических соединений. Для лабораторной диагностики определяющее значение имеют спектры протонного ядерного магнитного резонанса сыворотки, спинномозговой жидкости и мочи [3; 5]. Метаболомика уже показала высокую эффективность при обнаружении врожденных и наследственных нарушений метаболизма, нарушений метаболизма, вызванных эндогенными и экзогенными факторами, при трансплантациях (до и после), при изучении токсичности лекарственных препаратов (токсикогеномика), реакций организма на лекарственные препараты (фармакогеномика), при определении индивидуальных особенностей реакции организма на различные пищевые продукты.

Клиническая липидомика – важнейшее направление метаболомики. Нарушения липидного обмена связаны с такими заболеваниями, как атеросклероз, сахарный диабет, ожирение, болезнь Альцгеймера. Липидом – липидный профиль грубого липидного экстракта из образца – это масс спектр, характеризующий липидный состав и концентрации всех индивидуальных липидов образца. Подход основан на комбинации жидкостной хроматографии и масс-спектрометрического анализа [6]. Прогресс в липидомике достигнут благодаря разработке новых масс-спектрометрических подходов, в частности, методов «мягкой ионизации», таких как ионизация электрораспылением и матрично-активированная лазерная десорбция / ионизация. В частности, успехи применения метода масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением способствовали развитию «струйной» липидомики (shotgun lipidomics) и практическому применению разделения компонентов внутри источника ионов в качестве стратегии применения двумерной масс-спектрометрии для изучения состава липидов биологических образцов.

Липидомика подразделяется на:

• –    липидомику клеточной архитектуры и мембран (architecture / membrane lipidomics);

• –    липидомику медиаторов (mediator lipidomics).

С помощью липидомики строятся метаболические сети, в которых участвуют (практически) все липиды и медиаторы, являющиеся производными липидов. С помощью этого подхода уже установлено детальное строение мембран многих типов клеток, установлены механизмы активации провоспалитель-ных цитокинов, происходящие за счет медиаторов, связанных с липидами.

Нарушения метаболизма липидов связано с серьезными неврологическими патологиями, включающими биполярные расстройства и шизофрению, а также с нейродегене-ративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Неймана – Пика. Особенно большое значение имеет нейролипидомика спинномозговой жидкости.

В настоящее время персонализированная медицина стоит на пороге значительного расширения возможностей. Геномные и постгеномные технологии должны войти в повседневную практику в самое ближайшее время за счет действия специально ориентированных на это программ. Переоценить значение многомерной биологии для персонализированной медицины невозможно. Использование подходов многомерной биологии уже привело к выявлению новых механизмов возникновения и развития различных патологий, но исследования продолжаются.