Мочевые биомаркеры при остром пиелонефрите

• ¹Введение. Инфекции почек и мочевыводящих путей (ИМВП) относятся к самым распространенным Ответственный автор — Долгов Алексей Борисович

  Адрес: 410054, г. Саратов, ул. Новоузенская, 166/168, кв.26.

Тел.: +79179859253.

инфекционным заболеваниям, которые требуют существенных финансовых затрат. Например, в США ежегодно госпитализируется по поводу ИМВП более 100 тыс. человек, при этом наиболее распространенной нозологией является пиелонефрит, а прямые и непрямые затраты по поводу внебольничных ИВМП составляют более 1,6 млрд долларов в год [1]. Частота урогенитальной инфекции в амбулаторной практике (второе место по обращаемости после ОРВИ) и нозокомиальная инфекция мочевых путей (первое место среди всех видов нозокомиальных инфекций) также свидетельствуют о высокой актуальности данной проблемы [2]. И хотя большая часть пациентов с ИМВП имеют благоприятный прогноз, от 10 до 40% случаев пиелонефрита приводят к склерозированию ткани почки (особенно в детской популяции), что, в свою очередь, может привести к развитию хронической почечной недостаточности и к инвалидности [3]. Учитывая все изложенное, актуальность вопросов диагностики и лечения, а также профилактики рецидивов ИВМП представляется весьма высокой.

В исследованиях, проведенных к настоящему времени, убедительно доказано, что острый пиелонефрит запускает каскад реакций в паренхиме почки, которые впоследствии приводят к возникновению хронического воспалительного процесса и развитию фиброзных изменений в тубулоинтерстиции почки и эндотелиальной дисфункции. Увеличение числа обострений в процессе развития пиелонефрита формирует на уровне почечной паренхимы замкнутую патологическую систему, в которой участвуют тубулярный эпителий, нейтрофилы и макрофаги, а главной мишенью становится эндотелий [4–6].

К настоящему времени выявлен ряд медиаторов , участвующих в воспалительных процессах и развитии эндотелиальной дисфункции при пиелонефрите. К ним можно отнести в том числе IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, рецепторный антагонист IL-1 (IL-1RA), фактор некроза опухолей — альфа (TNF-α), С-реактивный белок (CRP). Показано, что для диагностики наличия острого воспалительного процесса может быть использовано исследование провоспалительных цитокинов [7, 8]. Опубликованы данные о том, что концентрацию некоторых из медиаторов воспалительного процесса можно определять в моче [7, 9, 10]. Преимущественно данные исследования проводятся в детской популяции [11], среди взрослых же исследования подобного рода весьма фрагментарны [9].

Вместе с тем именно такой неинвазивный метод количественного анализа биомаркеров воспаления перспективен для разработки новых технологий ранней диагностики острого пиелонефрита, оценки степени тяжести повреждения паренхимы почек [9]. Результаты данных исследований необходимы для уточнения тактики дальнейшего ведения больных (с помощью хирургического вмешательства и/или терапии). Оценка уровня биомаркеров может осуществляться как в сыворотке крови, так и в моче.

Цель исследования : оценка диагностического значения определения концентрации провоспали-тельных цитокинов в сыворотке крови и моче больных острым пиелонефритом, которая может быть использована для ранней диагностики и прогноза течения воспалительного процесса.

Материал и методы. Обследованы пациенты в возрасте от 23 до 63 лет (медиана 44,7 года) с наличием острого неосложненного пиелонефрита (n=21, из них женщин 17, мужчин 4), проходившие лечение в НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии Саратовского государственного медицинского университета им. В. И. Разумовского. Оценку активности и тяжести воспалительного процесса у больных проводили по результатам комплексного обследования, включавшего: изучение жалоб и сбор анамнеза; физикальное обследование пациента; ультразвуко- вое исследование; общий и биохимический анализ крови; обзорную рентгенографию почек и мочевых путей; в ряде случаев экскреторную урографию, компьютерную томографию с реконструкцией изображения, магнитно-резонансную томографию. Кроме того, в моче пациентов определяли общий белок, лейкоциты и эритроциты.

Диагностическими критериями острого пиелонефрита у данных пациентов являлись: наличие системных симптомов воспаления (фебрильная температура); местные проявления (боль в поясничной области); лейкоцитоз по данным ОАК; лейкоцитурия по данным ОАМ; присутствие более чем 10*5 КОЕ/ мл при посеве мочи. Пациенты с обструктивными уропатиями; доказанным иммунодефицитом; наличием онкоурологических заболеваний; любыми воспалительными заболеваниями иной локализации в стадии обострения в исследование не включались.

В качестве бактериальных агентов, вызывавших развитие пиелонефрита, были выявлены: Escherichia coli (n=16), Proteus mirabilis (n=3), Enterococcus faecalis (n=1), Staphylococcus Aureus (n=1). Лечение пациентов проводилось по стандартным схемам с применением препаратов первой линии выбора (цефалоспорины в\м и в\в; в ряде случаев фторхи-нолоны и аминопенициллины). Пациенты, самостоятельно начавшие антибактериальную и противовоспалительную терапию на преклиническом этапе, также исключались из исследования. По результатам лечения в течение 7–10 дней практически у всех пациентов был достигнут положительный клинический эффект. В дальнейшем пациенты получали необходимую антибактериальную, противовоспалительную терапию в соответствии со стандартом лечения заболевания.

Контрольная группа была сформирована из 20 практически здоровых лиц в возрасте от 35 до 65 лет.

Для количественного анализа биомаркёров взятие крови у пациентов исследуемой и контрольной групп проводили натощак, в утренние часы из кубитальной вены с использованием систем для забора крови «Vacuette» с активатором свертывания крови и разделительным гелем. Первую порцию утренней мочи в объеме не менее 100 мл собирали в специальные стаканы с крышками. Предварительно в емкость для забора мочи вносили 20 мкл раствора «ProClin 300» («SUPELCO», США). Аликвоты сыворотки крови и мочи разливали в пробирки с крышками типа «Eppendorf» и хранили до проведения исследования при температуре минус 25 ºС.

Концентрацию интерлейкинов (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10), рецепторного антагониста IL-1 (IL-1RA), фактора некроза опухолей — альфа (TNF-α), С-реактивного белка (CRP) в сыворотке крови и моче обследуемых пациентов определяли методом твердофазного им-муноферментного анализа (ИФА), используя соответствующие наборы реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Исследование всех биомаркеров у больных острым пиелонефритом проводили трехкратно: при поступлении в стационар до начала антибактериальной терапии (1-я точка); через 5–7 дней от начала курса лечения (2-я точка); через 1,5 месяца после завершения лечения (3-я точка).

Для оценки диагностической чувствительности и специфичности анализа перечисленных биомаркеров использовали ROC-анализ. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета Statistica 6.1. В качестве критерия достоверности отличия между двумя независимыми группами использовали непараметрический критерий (U) Манна — Уитни. Во всех процедурах статистического анализа принимался уровень значимости р<0,05.

Результаты. Подготовка проб сыворотки крови обследуемых пациентов для определения концентрации цитокинов достаточно хорошо отработана и не вызывает проблем в лабораториях, однако результаты количественного анализа этих маркеров в моче нередко имеют значимое расхождение. С целью стандартизации методики пробоподготовки этой биологической жидкости нами проведено исследование изменения уровня цитокинов в моче 5 больных пиелонефритом, а также в образцах их мочи, к которым добавлен консервант «ProClin 300», обладающий антимикробной активностью. В результате данного эксперимента показано, что в моче больных острым пиелонефритом, не содержащей консерванта, уже в течение двух часов при комнатной температуре происходит резкое снижение концентрации цитокинов, причем содержание TNF-α, IL-8 и IL-10 падает более чем в 10 раз (табл. 1). Следует отметить, что через 6 часов хранения при комнатной температуре без кон- серванта уровни цитокинов в моче условно здоровых доноров крови снижаются максимально на 15%.

Концентрация провоспалительных цитокинов в сыворотке крови и моче у больных с острым пиелонефритом до начала антибактериальной терапии (1-я точка исследований) представлена в табл. 2.

Отмечено нарастание уровней IL-6, IL-8, IL-1RA, TNF-α, CRP по сравнению с контрольной группой в сыворотке крови в 1,5–9,2 раза. Концентрация IL-10 и IL-1β по сравнению с группой контроля изменилась незначительно. Однако параллельно с этим отмечено резкое повышение концентрации большинства провоспалительных цитокинов в моче по сравнению с контрольной группой (в 10–1000 раз).

Из табл. 2 следует, что наиболее выраженный подъем концентрации в образцах мочи в точке 1 получен для цитокина IL-8. У всех пациентов уровни IL-8 в образцах сыворотки были очевидно ниже, чем в образцах мочи (рис. 1), что дает основание утверждать о локальной гиперпродукции данного вещества в мочевыделительной системе.

Обращает на себя внимание и выраженное повышение уровня CRP в моче в точке 1, хотя его уровень

Таблица 1

Концентрация цитокинов в моче пациентов с острым пиелонефритом при сборе мочи с консервантом и без консерванта

№ пробы	IL-1RA, пг/мл		TNF-α, пг/мл		IL-8, пг/мл		IL-10, пг/мл
	с ProClin	без ProClin	с ProClin	без ProClin	с ProClin	без ProClin	с ProClin	без ProClin
1	1209	652	532	0,4	173	17	1	0
2	7061	1406	2	0,7	415	41	9,9	0
3	8879	5857	177	0,4	309	24	1	0
4	3540	1728	429	0,4	162	16	1	0
5	1980	980	345	0,4	240	46	1	0

П р и м еч а н и е : IL-1RA — антагонист рецепторов интерлейкина -1; TNF-α — фактор некроза опухоли — α; IL- 8-интерлейкин -8; IL-10 — интерлейкин –10.

Таблица 2

Медиана концентрации биомаркера, диапазон квартильных отклонений

Определяемый биомаркер	Условно здоровые (контроль), n=20		Больные с острым пиелонефритом, n=21
			1-я точка		2-я точка		3-я точка
	в сыворотке	в моче	в сыворотке	в моче	в сыворотке	в моче	в сыворотке	в моче
IL-1β, пг/мл	3,7 1,7–7,3	2,2 1,8–3,2	1,0 0,9–1,1	5,1* 3,2–8,9	1,0 0,9–1,1	1 0,9–3,0	1 1,0–1,0	1 1,0–1,8
IL-6, пг/мл	2,4 1,6–3,1	2,9 2,1–3,9	22,0* 14,5–59,9	131,0* 61,3–591,5	0,5 0,5–2,2	6,4* 5,5–9,7	0,5 0,5–1,4	4,8* 3,9–6,8
IL-8, пг/мл	6,1 5,0–8,9	0,4 0,0–12,1	8,9* 7,9–10,8	414,5* 94,3–1065,6	2,0 1,8–2,1	24,8* 14,5–52,3	10,9* 8,6–12,6	32,5* 20,6–45,5
TNF-α, пг/мл	2,3 1,4–3,2	2,4 1.9–2,9	3,8* 3,1–4,6	214,7* 2,0–352,3	2,0 2,0–2,8	2,6 2,0–3,8	2,6 2,2–3,5	3,2 2,8–3,5
IL-10, пг/мл	2,2 1,6–3,4	3,5 3,1–4,9	1,0 1,0–2,1	1,5 1,0–6,0	1,0 1,0–1,2	1 1,0–1,2	20,9* 16,8–24,5	3,4 3,1–3,5
IL-1RA,пг/мл	230 170–300	1150 990–1260	480* 390–650	6510* 4680–8580	640* 470–720	2340* 2250–3080	2580* 1030–4020	6110* 5860–6780
CRP, мкг/мл	1,2 0,90–1,50	0,63 0,29–1,08	1,6 0,6–3,3	6,50* 2,3–18,4	4,3* 2,6–11,4	5,15* 1,9–12,2	2,7* 2,0–3,5	0,12 0,09–0,15

П р и м еч а н и е : * — р<0,05 в сравнении с контрольной группой.

Концентрация цитокинов в сыворотке крови и моче пациентов с острым пиелонефритом

Рис. 1. Концентрации IL-8 в парах сыворотка — моча больных с острым пиелонефритом (1-я точка исследований)

Рис. 2. Кратность превышения концентрации цитокинов в моче у больных с острым пиелонефритом относительно контрольной группы в динамике

Рис. 3. Кратность превышения концентрации цитокинов в сыворотке крови у больных с острым пиелонефритом относительно контрольной группы в динамике

в сыворотке крови пациентов остается в пределах нормы или незначительно повышен.

Через 5–7 суток после начала антибактериальной терапии (точка 2) содержание провоспалительных цитокинов в сыворотке крови и моче больных существенно снижается (см. табл.2). Концентрации IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α в сыворотке сопоставимы с группой контроля, а в моче — превышает их в меньшей степени, нежели в точке 1. Сывороточная концентрация IL-1RA и CRP в исследуемой группе, несмотря на проводимое лечение, продолжает нарастать. Однако их содержание в моче снижается, хотя все еще превышает нормальные значения.

Через 1,5 месяца после проведенного лечения (точка 3) наблюдаются разнонаправленные изменения концентраций исследованных биомаркеров как в сыворотке крови, так и в моче (см. табл. 2).Уровни IL-1β, TNF-α больше не изменяются, оставаясь в пределах нормы как в сыворотке крови, так и в моче . Содержание CRP в сыворотке крови снижается, однако остается более высоким, чем в контрольной группе;

концентрация же CRP в моче резко падает, достигая значений здоровых людей. Содержание IL-8 в сыворотке крови и моче снова возрастает. Однако данный подъем является не столь существенным, как на пике заболевания. Концентрация IL-1RA повышается в обеих пробах, практически достигая уровня точки 1 в моче. На протяжении всего исследования IL-10 у пациентов с пиелонефритом остается в пределах нормы в моче, однако в точке 3 его содержание в сыворотке увеличивается на порядок (рис. 2, 3).

Диагностическое значение исследования содержания провоспалительных цитокинов в моче при остром пиелонефрите по анализу чувствительности и специфичности оценивалось с помощью построения характеристической кривой (ROC-анализ). Результаты ROC-анализа и ROC-кривые зависимости чувствительности от вероятности ложноположительных результатов приведены в рис. 4 и в табл. 3, 4.

Информативность каждого из цитокинов в моче оценивалась по величине площади под кривой. Диагональ (50% площади квадрата) свидетельствовала

Таблица 3

Результаты ROC-анализа для диагностически значимых цитокинов в сыворотке крови

Показатель	IL-6	IL-8	TNF-α	IL-1RA	CRP
Площадь под кривой	0,852	0,719	0,809	0,901	0,578
Отсечка*	8	8	4,2	388	1,8
Специфичность	0,99	0,65	0,85	0,88	0,93
Чувствительность	0,8	0,68	0,43	0,73	0,45

П р и м еч а н и е : * — для цитокинов в пг/мл и для CRP в мкг/мл.

Таблица 4

Результаты ROC-анализа для диагностически значимых цитокинов в моче

Показатель	IL-6	IL-8	TNF-α	IL-1RA	CRP
Площадь под кривой	0,97	0,988	0,822	0,998	0,91
Отсечка*	7	32	6	2970	1,3
Специфичность	0,92	0,95	0,92	0,97	0,91
Чувствительность	0,94	0,94	0,66	0,98	0,82

П р и м еч а н и е : * — для цитокинов в пг/мл и для CRP в мкг/мл.

об отсутствии значимых различий изменения показателя в двух сравниваемых группах. На характеристических кривых выбраны диагностические пороги (точки разделения), которым соответствуют максимально возможные чувствительности и специфичности выявления активности воспалительного процесса в ткани почки для исследуемого показателя.

Рис. 4. ROC-кривые диагностической эффективности определения уровня IL-8 в моче и сыворотке крови для выявления острого пиелонефрита

Обсуждение. Основной причиной значительного падения концентрации цитокинов в моче больных острым пиелонефритом, очевидно, может быть контаминация ее микроорганизмами, которые в процессе жизнедеятельности секретируют большое количество различных, в том числе протеолитических ферментов, способных к инактивации или деструкции этих биомаркеров. Это, с одной стороны, объясняет низкую сходимость результатов анализа цитокинов в моче, получаемых разными авторами, а с другой — подчеркивает особую важность стандартизации преаналитического этапа в данных лабораторных исследованиях. Полученные результаты дают основание утверждать, что для определения биомаркёров в моче необходимо использовать консервант с противомикробной активностью, например «ProClin 300». Применение вещества такого типа позволяет предотвратить раннюю деструкцию провоспалитель-ных цитокинов в моче и может быть рекомендовано в качестве одного из методов стандартизации на до-аналитическом этапе в исследованиях.

Изменения в уровне исследуемых веществ имели различный характер. С одной стороны, до начала антибактериальной терапии отмечалось повышение уровней IL-6, IL-8, IL-1RA, TNF-α, CRP в сыворотке крови. Повышение концентрации этих же веществ в моче было на порядок выше. Таким образом, цитокины IL-6, IL-8, TNF-α, IL-1RA, определяемые в сыворотке крови, и IL-6, IL-8, TNF-α, IL-1RA, и С-реактивный белок, определяемые в моче, могут рассматриваться как критерии воспалительного процесса, развивающегося на уровне паренхимы почек. Нарастание уровня этих маркёров выше указанных значений свидетельствует о наличии острого воспалительного процесса. Наибольшую диагностическую значимость для раннего выявления воспаления и прогнозирования его развития у больных острым пиелонефритом имеют определения IL-6, IL-8, IL-1RA, TNF-α и СRP именно в моче.

Необходимо отметить, что у всех обследованных пациентов подъем уровня провоспалительных цитокинов в сыворотке крови и в моче был связан с клиническими проявлениями обострения воспалительного процесса. При этом пациенты, у которых антибактериальная терапия была клинически эффективна с первых часов заболевания, имели более низкий уровень исследуемых биомаркеров во 2-й и 3-й точках исследования. В некоторых случаях, на ранних стадиях воспалительного процесса, повышение концентрации биомаркеров может являться решающим диагностическим критерием, свидетельствующим о наличии воспалительного процесса у пациента именно в почечной паренхиме. Подтверждением этого может служить следующий клинический пример :

Больная Н., 23 лет. Госпитализирована с Ds: «Абсцесс правой почки. Правосторонний паранефрит». Жалобы при поступлении на тянущие боли в поясничной области справа, периодический подъем температуры тела до 38,0º С в течение 15 суток до госпитализации. По данным анамнеза, пациентка в течение 15 суток до госпитализации отмечала периодические тянущие боли в поясничной области справа, сопровождавшиеся лихорадкой до 38,0º С. Данные ОАМ, выполненного амбулаторно: лейкоциты 1–2 в п/зр., уд. вес 1020, белок отр., сахар отр., эпителий ед. кол-во. Принимала НПВС, осуществлялось местное симптоматическое лечение с нестабильным положительным эффектом, сохранялась субфебрильная температура тела. Антибактериальная терапия не назначалась. За двое суток до поступления пациентка отметила резкое повышение температуры до 39,5º С, с ознобом; усиление болей в поясничной области справа. Данные физикального обследования: рефлекторное напряжение мышц брюшной стенки справа, пальпация правой почки резко болезненна, симптом поколачивания по поясничной области резко положительный справа. Псо-ас-симптом положительный справа. Данные лабораторных методов обследования: ОАК: эритр. 2,93*10 (12), гемоглобин 83 г/л, лейк. 21,8*10 (9), палочкоядерные 32%, сегментоядерные 57%, лимфоциты 4%, моноциты 5%, СОЭ 66 мм/ч. Биохимический анализ крови: креатинин 87 мколь/л, мочевина 3,7 ммоль/л, белок 79 г/л. ОАМ: белок 0,033 г/л, лейкоциты 3–5 в п/зр., эритроциты 1–2 в п/зр. Ультразвуковое исследование почек: размеры правой почки: 11,1*5,4 см; дыхательная экскурсия правой почки отсутствует, в среднем сегменте имеется очаговое образование пониженной эхогенности, неоднородное, с нечеткими и неровными контурами, размерами около 4,5*4,7 см. Данных за наличие обструкции мочевыводящих путей нет. В экстренном порядке выполнено оперативное лечение в объеме: «Вскрытие, дренирование абсцесса правой почки, тотального гнойного паранефрита справа». Данные посева отделяемого из раны: обнаружен Staphylococcus aureus 10*4. Послеоперационный период протекал без осложнений. Проводилась антибактериальная терапия: Ceftriaxo-ni 2.02 р/с в/в кап.; Sol. Ciprofloxacini 200 mg 2 р/с в/в кап. — 10 дней; затем Tab. Amoxicillini 500 mg 2 р/с per os. Результаты исследования провоспалительных цитокинов мочи больной Н. представлены в табл. 5.

Таблица 5

Результаты исследования провоспалительных цитокинов в моче

Точка исследования	Ил-1β пг/мл	Ил-6 пг/мл	Ил-8 пг/мл
До начала лечения	18,4	112,1	412,8
Через 5–7 дней от начала лечения	15,358	9,7	180,8
Через 1,5 месяца от начала лечения	2,27	2,21	49,14

Как видно, у пациентки имел место выраженный подъем провоспалительных цитокинов на высоте клинических проявлений острого гнойного пиелонефрита. Стоит отметить, что в данном случае при проведении дифференциальной диагностики на амбулаторном этапе по поводу лихорадки неясной этиологии отсутствовали характерные изменения в общем анализе мочи. И исследование уровня цитокинов в моче могло бы сыграть решающую роль в определении локализации воспалительного процесса и выборе тактики лечения.

Заключение. Таким образом, анализ изменения уровня цитокинов и С-реактивного белка в сыворотке крови и моче при остром пиелонефрите показал, что данные показатели могут рассматриваться в качестве критериев активности воспалительного процесса. При этом наибольшую диагностическую значимость имеет нарастание концентрации этих веществ именно в моче. Мониторинг концентрации цитокинов в этой биологической жидкости является неинвазивным и доступным для применения методом исследования, позволяющим клиницисту дать оценку выраженности воспалительного процесса в мочевыводящих путях.

Обнаруженная динамика содержания CRP в моче и сыворотке крови позволяет сделать предположение о том, что данное вещество играет существенную роль в формировании локального иммунного ответа непосредственно в момент обострения воспалительного процесса и может являться одним из критериев для определения степени выраженности данного процесса.

Полученные данные позволяют предположить, что исследование уровня цитокинов в моче может быть использовано для оценки тяжести воспалительных изменений паренхимы почки и при мониторинге эффективности противовоспалительной терапии.