Моделирование действия биологически активных веществ на проницаемость клеточной оболочки

Материалы и методы: Мелафен — меламиновая соль бис гидроксиметил) фосфиновой кислоты, синтезирован в ИОФХ РАН им. А. Е. Арбузова. Эритроциты получали осаждением из крови мышей в физ. растворе 0,9% NaCl, т.е. 0,15 М NaCl. Ионную силу среды инкубации эритроцитов и измерения степени гемолиза изменяли путем добавления концентрированных растворов NaCl для достижения от 0 М до 4 М. В концентрированной суспензии эритроцитов (0,2 г/мл) уже содержался 0,9% NaCl и трис-НCl (рН 7,4), поэтому при добавлении (1 мл эритроцитов в 10 мл среды) в среду с 0М NaCl, достигалась концентрация NaCl в 2 раза ниже физиологической. Гемолиз проводился в течение 45 мин при комнатной температуре. Устойчивость эритроцитов к гемолизу изучали по методу Ягера [6]. С помощью СФ-2000 фотометрически определяли (λ=532 нм) количество гемоглобина, поступающего в среду вследствие спонтанного лизиса мембран эритроцитов, индуцированного окислением липидов кислородом воздуха или условиями эксперимента. Измеряли гемолиз 5%-ной суспензии эритроцитов в среде, содержащей 0,1 М трис-HCl-буфер и физ.

раствор в соотношении 1:1, NaCl (0; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4 М) и мелафен (10–3, 10–5, 10–7, 10–9, 0 М)

Результаты: Два подхода ведут к повышению сохранности эритроцитов при изменении условий среды. 1) Предшествующая модификация состояния цитоскелет-мем-бранного комплекса. Частичное обезвоживание клеток (в гиперосмотической среде) увеличивает концентрации белков в объеме внутриклеточного растворителя, это приводит к увеличению числа структурных связей белков цитоскелета с мембраной и между собой и к стабилизации плазматической мембраны. 2) Применение биологически активных веществ, влияющих на структуру и функции мембраны. Также на формирование гемолитической поры оказывает влияние цитоскелет, липиды, ионные потоки. Предварительные исследования воздействия БАВ были выполнены на модельных биообъектах животного происхождения. Экспериментальные объекты можно расположить в ряд по степени усложнения структуры: мультиламел-лярные фосфолипидные липосомы, сформированные из индивидуального синтетического фосфолипида — дими-ристоилфосфатидилхолина; мультиламеллярные фосфолипидные липосомы, сформированные из смеси природных фосфолипидов — яичного лецитина; тени эритроцитов; эритроциты; клетки асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ). Для выяснения концентрационных диапазонов, в которых применение БАВ не вызывает разрушения структуры объектов, тестирование проводили, используя широкий концентрационный диапазон. Перечислим предпосылки для проведения настоящей работы из наших исследований влияния водных растворов мелафена. Морфология эритроцитов — меняется — объем уменьшается [4], что может являться предшествующей обработкой. Микровязкость мембран меняется: средние концентрации увеличивают, большие — уменьшают. Белковые микродомены цитоскелета не изменяются [3]. В липидном бислое мелафен вызывает перестройки микродоменов [2]. Толщину бислоя и период укладки бислоев в мультислоях, которые имитирую внутриклеточные мембраны, мелафен не меняет [2]. Ионные потоки, которые отражаются: 1) в морфологии эритроцитов — мелафен меняет [4]; 2) в функционировании клеток АКЭ (рецепторных ответах на стимуляцию) — ме-лафен меняет Са2-зависимые К и Сl- потоки и объемные параметры клеток [5]. Исходя из предыдущих исследований [2–5], показавших влияние мелафена в широком диапазоне концентраций на структуру липидных бислоев и теней эритроцитов, а также на клеточные функции АКЭ, в настоящей работе тестировали влияние мелафена в концентрациях от 10–12 М до 10–3 М на гемолиз эритроцитов в гипо- и гипер-осмосмотических условиях создаваемых добавками NaCl. Гемолиз изолированных из цельной крови эритроцитов увеличивался в зависимости от ионной силы среды инкубации при концентрации NaCl (0; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,54 М). При исследовании in vitro влияния ме-лафена на гемолиз эритроцитов непосредственно после выделения из цельной крови мышей было обнаружено, что большие концентрации мелафена, добавляемые к вы-

ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫЕ ОПУХОЛИ

Российское общество клинической онкологии

Российский онкологический конгресс

Экспериментальная онкология деленным эритроцитам, значительно усиливают гемолиз эритроцитов при низкой ионной силе (более 50%) и все концентрации мелафена меньше влияют (до 30%) при высокой ионной силе. В опытах in vivo, при инъекциях всех доз мелафена внутрибрюшинно мышам, обнаруживалась сходная картина для малых сроков инъецирования (1 час, 1 сутки, 3 суток) с высоким уровнем гемолиза при малых концентрациях NaCl до 0,5М и низким уровнем при больших дозах. При сроках 8 суток для всех концентраций инъецированного мелафена наблюдались сходные закономерности с возрастанием уровня гемолиза в зависимости от концентрации NaCl. Увеличение степени гемолиза по сравнению с контрольной составляло 20–30%. Вероятно, происходило метаболизирование мелафена за длительный срок присутствия БАВ в организме мышей.

Заключение: Выявлено in vivo, in vitro действие мелафе-на на степень гемолиза эритроцитов, добавочное к действию изменения ионной силы. Мелафен, в концентрациях 10–3 М, 10–5 М, 10–7 М, 10–9 М значительно увеличивает проницаемость мембран эритроцитов для гемоглобина. Это свидетельствует о добавочном нарушении целостности мембран в присутствии разных значений ионной силы экспериментальной среды. Мелафен вызывает дополнительную проницаемость мембран в условиях осмотического стресса, и как протектор целостности клеточной мембраны не применим. Последовательность предварительных исследований действия БАВ на ряд усложняющихся модельных экспериментальных объектов может служить основой для проведения тестирования среды хранения клеток в условиях глубокой заморозки без нарушения целостности оболочки.