Моделирование хронического остеомиелита в эксперименте

Автор: Королев Святослав Борисович, Митрофанов Вячеслав Николаевич, Живцов Олег Петрович, Орлинская Наталья Юрьевна, Юлина Дарья Петровна

Журнал: Гений ортопедии @geniy-ortopedii

Рубрика: Оригинальные статьи

Статья в выпуске: 2 т.28, 2022 года.

Бесплатный доступ

Введение. В существующих моделях остеомиелита нет унифицированной схемы создания патологического очага. Для получения достоверных сравнительных данных разных авторов и воспроизводимости экспериментальной модели необходимо унифицировать локализацию, размер дефекта, дозирование инфицирующего агента и материал носителя. Цель. Демонстрация результатов разработки экспериментальной модели хронического остеомиелита с унифицированной схемой создания патологического очага. Материалы и методы. Исследование выполнено на 15 кроликах. Животным формировали идентичный дефект в проксимальном метаэпифизе большеберцовой кости четырехгранным конусовидным сверлом диаметром 0,5 см с ограничителем на глубину 0,5 см. В дефект погружали заранее приготовленный фрагмент аллокости, импрегнированный взвесью Staphylococcus aureus с концентрацией микробных клеток 1,0 × 108 КОЕ/мл. На 3-й день после оперативного вмешательства производили удаление части швов из средней трети раны и разведение её краев для инициирования свищевого хода. Период наблюдения составил 21 день. Контроль формирования модели осуществляли посредством клинического наблюдения, изучения воспалительных изменений периферической крови, бактериологического, рентгенологического, патоморфологического исследований. Результаты. После оперативного вмешательства у животных наблюдалось снижение физической активности, повышение температуры тела, нарушение функции оперированной конечности, в области послеоперационной раны формировался незаживающий свищевой ход с обильным гнойным отделяемым творожистой консистенции. По данным компьютерной томографии на 21 день после операции визуализировали полость с неровными склерозированными краями, заполненную множественными костными секвестрами, отеком прилежащих мягких тканей и наличием свищевого хода. В периферической крови отмечался лейкоцитоз. По данным бактериологического исследования раневого отделяемого выявлен рост Staphylococcus aureus. По результатам патоморфологического исследования определялись костные дефекты проксимального метаэпифиза большеберцовой кости с участками некрозов, выраженной лейкоцитарной инфильтрацией, фрагментами расплавляющейся костной ткани, разрастанием соединительной ткани, окружающей очаги хронического гнойного воспаления, что подтверждало формирование хронического остеомиелита. Разработана экспериментальная модель хронического остеомиелита с применением унифицированных параметров локализации, размера дефекта, дозирования инфицирующего агента и материала носителя. Способ прост в техническом исполнении, не требует дополнительного инфицирования и обеспечивает формирование хронического остеомиелитического процесса в течение 21 дня. Обсуждение. В своей модели мы применяли аллокость, позволяющую путем импрегнации микробной взвеси вызывать инфицирование, без дополнительного удаления носителя. В ходе исследования определили количество инфицирующей взвеси, поглощаемое аллокостью, необходимое для развития остеомиелитического процесса и не приводящее к гибели животного от септических осложнений. Для осуществления пассивного дренажа раны формировали свищевой ход и поддерживали его функционирование, таким образом остеомиелитический очаг был локализован и обеспечил выживаемость животных на всем сроке эксперимента. Выводы. Продемонстрированы результаты разработки экспериментальной модели хронического остеомиелита с применением унифицированной схемы создания патологического очага. Созданная модель позволила избежать генерализации остеомиелитического процесса, обеспечить выживаемость животных на всем сроке эксперимента и смоделировать процесс, соответствующий патоморфологическим изменениям, характерным для хронического остеомиелита человека.

Еще

Хронический остеомиелит, остеомиелитические дефекты, экспериментальная модель

Короткий адрес: https://sciup.org/142234580

IDR: 142234580

Текст научной статьи Моделирование хронического остеомиелита в эксперименте

В структуре заболеваний опорно-двигательного аппарата хронический остеомиелит составляет 10–25 % [1–4]. Неудовлетворительные результаты лечения и рецидивы данного заболевания достигают 40 % [5–7], а частота инвалидизации больных превышает 50 % [8, 9]. Совершенствование способов хирургического лечения остеомиелита требует проведения доклинических экспериментальных исследований. Известные модели трудоемкие, двухэтапные, предусматривают дополнительное инфицирование и повторное оперативное вмешательство, что повышает риск септических осложнений и гибели животного [10, 11]. Количество инфицирующего агента варьирует в широком диапазоне, не учитывается время экспозиции [12, 13] и способ введения инфицирующей смеси на носи- тель [14, 15]. Формируемые дефекты имеют различную форму и размеры, что может искажать результаты эксперимента. В качестве инфекционного носителя используют различные материалы: раствор агар-агара [14], лавсановую ткань [16], стерильный кварцевый песок [17], физиологический раствор [18, 19], металлический штифт [20], костный цемент [21]. Для получения достоверных сравнительных данных и воспроизводимости экспериментальной модели необходимо унифицировать размер, локализацию дефекта, количество инфицирующего агента и материал носителя.

Цель : демонстрация результатов разработки экспериментальной модели хронического остеомиелита с унифицированной схемой создания патологического очага.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперимент проводился в виварии ФГБОУ ВО «ПИМУ», сертифицированном Государственной ветеринарной службой Нижегородской области согласно приказу Минздравсоцразвития РФ № 708н от 23.08.2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики», в соответствии с «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Страсбург, 18.05.2014 г.) и оборудованном по категории «Specific pathogen free» (SPF), что позволяет содержать конвенциональных животных 2 класса чистоты (МD).

Создание модели осуществляли следующим способом: фрагмент аллокости весом 1 грамм погружали на 15 минут в раствор микробной взвеси плотностью 1 г/мл с концентрацией микробных клеток 6,0 × 108 КОЕ/мл. Контрольными взвешиваниями (весы электронные DX-200WP) установили поглощение аллогенной костью 0,01 грамма раствора микробной взвеси с концентрацией микробных клеток 1,5 × 108 КОЕ/МЛ, подтвержденное бактериологическими посевами по методу серийных разведений. До момента применения аллокость с импрегнированной микробной взвесью замораживали при температуре -70˚. На контрольном измерении перед использованием в эксперименте содержание микроорганизмов сохранялось.

Оперативное вмешательство животным проводили под комбинированным обезболиванием в положении на спине. Выполняли доступ к внутренней поверхности проксимального метаэпифиза большеберцовой кости. Формировали идентичный костный дефект четырехгранным конусовидным сверлом диаметром 0,5 см с ограничителем на глубину 0,5 см. В зону дефекта погружали предварительно инфицированный микробной взвесью фрагмент аллокости, соответствующий размеру дефекта. Производили послойное ушивание раны.

На 3-й день после оперативного вмешательства производили удаление части швов из средней трети раны и разводили края для инициирования свищевого хода. На 7-ой день осуществляли взятие материала для бактериологического исследования. Животных выводили из эксперимента методом воздушной эмболии на 21-й день эксперимента и выполняли компьютерную томографию для оценки формирования остеомиелитического очага.

Полученный при выведении лабораторных животных из эксперимента материал фиксировали в 10 % формалине и декальцинировали в специальном декальцинирующем растворе (Биодек) при температуре 37 ºС в течение 24 часов. Затем экспериментальный материал подвергали обезвоживанию в спиртах восходящей концентрации, начиная с 70 % спирта и до абсолютного. После помещения в ксилол материал подвергали заливке в парафин. Стандартную гистологическую проводку осуществляли на аппарате «Excelsior ES» (Thermo Scientific). После проводки изготавливали парафиновые блоки с использованием заливочной станции «HistoStar» (Thermo Scientific). Серийные срезы толщиной 4–6 микрон получали на микротоме «Microm HM 325» (Thermo Scientific). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

Для морфологической оценки полученного экспериментального материала использовали микроскоп Leica DM 2500, объектив ×5, ×10, ×20, ×40, ×100, окуляр ×10.

С целью определения системной реакции организма оценивали уровень гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов в первый и 21-й день эксперимента. Результаты эксперимента регистрировали в виде электронных таблиц MS Office Excel (2007) и обрабатывали c использованием интернет-портала medstatistic.ru. Сопоставление признаков между группами сравнения проводили с использованием парного t-критерия Стьюдента для связанных совокупностей при уровне значимости p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

У животных к 3-му дню после оперативного вмешательства наблюдалось снижение физической активности, повышение температуры тела, нарушение функции оперированной конечности. С 3-го дня после снятия части швов и разведения краев послеоперационной раны выделялось умеренное количество геморрагического отделяемого, которое к 7–10 дню сменялось гнойным отделяемым жидкой или творожистой консистенции. На 14-й день эксперимента формировался незаживающий свищевой ход. На 21-й день эксперимента сохранялся функционирующий свищевой ход, восстанавливалась опороспособность оперированной конечности, отмечалось улучшение аппетита, температура тела нормализовалась.

По данным компьютерной томографии на 21-й день после операции у всех животных в проксимальном метаэпифизе большеберцовой кости визуализировали полость с неровными склерозированными краями, заполненную множественными костными секвестрами, отек прилежащих мягких тканей и свищевой ход (рис. 1).

Рис. 1. Компьютерная томография остеомиелитического очага в проксимальном метаэпифизе правой большеберцовой кости на 21-й день после операции

У животных отмечено статистически не значимое снижение уровня гемоглобина и эритроцитов, что демонстрировало стабильность их состояния. Уровень лейкоцитов повысился с 7,673 ± 1,095 × 109/л до 9,667 ± 1,793 × 109/л (p = 0.003), что интерпретировалось как показатель наличия локального воспалительного процесса (рис. 2).

По данным бактериологического исследования у всех кроликов был выявлен рост Staphylococcus aureus .

Рис. 2. Уровень лейкоцитов крови в первый (109/л) и 21-й дни эксперимента

При макроскопическом исследовании экспериментального материала образцы были представлены костно-мягкотканными фрагментами проксимального метаэпифиза большеберцовой кости размерами 2 × 2 см с округлыми дефектами 0,5 × 0,5 см, заполненными гнойным отделяемым с очагами размягчения костной ткани в центре. По периферии костного дефекта визуализированы зоны бурого цвета, очевидно, кровоизлияний (рис. 3).

Рис. 3. Остеомиелитический очаг метаэпифизарной области большеберцовой кости

При микроскопическом исследовании определяли костные дефекты проксимального метаэпифиза большеберцовой кости с участками некрозов, выраженной лейкоцитарной инфильтрацией, фрагментами расплавляющейся костной ткани, разрастанием соединительной ткани, окружающей очаги хронического гнойного воспаления, что подтверждало формирование хронического остеомиелита (рис. 4).

Рис. 4: а – лейкоцитарная инфильтрация костного дефекта с участками некроза; б – фрагменты расплавляющейся костной ткани; в – разрастание соединительной ткани, окружающей очаг хронического гнойного воспаления. Окраска гематоксилином и эозином, ×20

ОБСУЖДЕНИЕ

При разработке модели хронического остеомиелита мы использовали унифицированную схему создания патологического очага, которая не требовала дополнительного инфицирования, повторных оперативных вмешательств, удаления носителя и позволила инициировать остеомиелитический процесс у всех животных. Мы не разделяем точку зрения авторов патента [10], которые утверждают, что для развития остеомиелитического процесса у всех животных необходима предварительная сенсибилизация. Наоборот, согласны с другими авторами [14] и считаем, что сенсибилизация повышает риск генерализации остеомиелитического процесса и может приводить к гибели животного.

Важное значение при разработке модели остеомиелита имеет способ введения инфицирующего агента и материал носителя. При использовании в качестве инфекционного носителя физиологического раствора и инъекционном пути введения взвеси отмечается образование обширных абсцессов, свищей мягких тканей с развитием сепсиса и гибели животных [11]. Чтобы локализовать инфицирующую взвесь в месте введения применяют дополнительную пломбировку, но при отсутствии дренирования раны возрастает риск генерализации остеомиелитического процесса [14]. Инъекционный вариант инфицирования с формированием остеомиелитического очага в дистальном метаэпифизе бедренной кости применяли авторы другого патента [13], при использовании нами данного способа 3 кролика из 5 погибли в связи с развитием септических осложнений. Мы отказались от данной модели, изменив локализацию очага на передневнутреннюю поверхность проксимального метаэпифиза большеберцовой кости, что обеспечило отсутствие осложнений.

Ограничить возможность распространения инфицирующей взвеси в окружающие ткани можно при использовании в качестве носителя вязких веществ – желатин, агар-агар [10, 14]. Стоит отметить неудобство использования таких материалов носителя, которые требуют дополнительного вмешательства для удаления (стерильный кварцевый песок, костный цемент, лавсановую нить). В своей модели мы применяли аллокость, как наиболее физиологичный материал, позволяющий путем импрегнации микробной взвеси вызывать локальное инфицирование без дополнительного удаления носителя.

Для осуществления пассивного дренажа раны мы формировали свищевой ход на 3-й день и поддерживали его функционирование в течение 21-го дня, таким образом остеомиелитический очаг был локализован. Это позволило избежать местных, системных осложнений и обеспечило выживаемость животных на всем сроке эксперимента. В ходе исследования мы определили количество инфицирующей взвеси, поглощаемое аллокостью, необходимое для развития остеомиелитического процесса и не приводящее к гибели животного от септических осложнений. Это позволило не проводить кроликам антибактериальной терапии, которая является частой причиной летальных исходов в результате дисбактериоза и нарушения функции желудочно-кишечного тракта.

Формирование хронического остеомиелита в более ранних моделях происходило на сроках 8 недель [12], 6 недель [11, 13, 18, 19], 30 и 31-е сутки [14, 15]. Предложенная модель позволила создать очаг хронического остеомиелита, подтвержденный данными гистологического исследования, в течение 21 дня, обеспечив снижение материальных затрат и уменьшив срока выполнения эксперимента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Продемонстрированы результаты разработки экспериментальной модели хронического остеомиелита с унифицированной схемой создания патологического очага [22]. Всем животным создавали конусовидный стандартный дефект в проксимальном метаэпифизе большеберцовой кости диаметром 0,5 см и глубиной 0,5 см, в который погружали заранее приготовленную аллокость, импрегнированную взвесью Staphylococcus aureus с концентрацией микробных клеток 1,0 × 108 КОЕ/мл.

Предложенный способ позволил избежать локальных и системных осложнений остеомиелитического процесса, обеспечить выживаемость животных на всем протяжении эксперимента, сократить сроки фор- мирования модели до 21 дня и смоделировать процесс, соответствующий патоморфологическим изменениям, характерным для человека. Способ технически прост, легко воспроизводим, сокращает материальные затраты и сроки выполнения экспериментов, направленных на совершенствование методов лечения остеомиелита.

Таким образом, нам удалось достигнуть поставленной цели, продемонстрировав результаты разработки экспериментальной модели хронического остеомиелита с применением унифицированных параметров локализации, размера дефекта, дозирования инфицирующего агента и материала носителя, что позволит экспериментаторам получать достоверные и сравнимые результаты.

Список литературы Моделирование хронического остеомиелита в эксперименте

  • Винник Ю.С., Маркелова Н.М., Шагеев А.А. Хронический остеомиелит: диагностика, лечение, профилактика // Сибирское медицинское обозрение. 2009. № 6. C. 12-15.
  • Мироманов А.М., Борзунов Д.Ю. Доклиническая диагностика хронического травматического остеомиелита при переломах длинных костей конечностей // Гений ортопедии. 2012. № 4. С. 21-23.
  • Posttraumatic and postoperative osteomyelitis: surgical revision strategy with persisting fistula / S. Ayta^, M. Schnetzke, B. Swartman, P. Herrmann, C. Woelfl, V. Heppert, P.A. Gruetzner, T. Guehring // Arch. Orthop. Trauma Surg. 2014. Vol. 134, No 2. P. 159-165. DOI: 10.1007/s00402-013-1907-2.
  • Современные аспекты этиологии, диагностики и лечения остеомиелита / Н.В. Сакович, А.А. Андреев, Е.В. Микулич, А.П. Остроушко, В.Г. Звягин // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. 2018. Т. 11, № 1. C. 70-79. DOI: 10.18499/2070-478X-2018-11-1-70-79.
  • Хронический посттравматический остеомиелит плеча: экономические аспекты лечения методом чрескостного остеосинтеза аппаратом Илизарова / Д.С. Леончук, Н.В. Сазонова, Е.В. Ширяева, Н.М. Клюшин // Гений ортопедии. 2017. Т. 23, № 1. C. 74-79.
  • Новомлинский В.В. Применение лазерных технологий и аквакомплекса глицеросольвата титана в лечении хронического остеомиелита // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. 2016. Т. 9, № 2. C. 156-164. DOI: 10.18499/2070-478X-2016-9-2-156-164.
  • Chronic recurrent multifocal osteomyelitis / J. Wipff, C. Adamsbaum, A. Kahan, C. Job-Deslandre // Joint Bone Spine. 2011. Vol. 78, No 6. P. 555560. DOI: 10.1016/j.jbspin.2011.02.010.
  • Миронов С.П., Цискарашвили А.В., Горбатюк Д.С. Хронический посттравматический остеомиелит как проблема современной травматологии и ортопедии (обзор литературы) // Гений ортопедии. 2019. Т. 25, № 4. C. 610-621.
  • Ишутов И.В., Алексеев Д.Г. Основные принципы озонотерапии в лечении пациентов с хроническим остеомиелитом // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. 2011. Т. 4, № 2. С. 314-320.
  • Способ моделирования травматического остеомиелита : пат. 2584402 Рос. Федерация, МПК G 09 B 23/28 / Авдеева Е.Ю., Слизовский Г.В., Скороходова М.Г., Фомина Т.И., Зоркальцев М.А., Иванов И.В., Краснов Е.А. ; заявитель и патентообладатель Сибирский государственный медицинский университет. № 2015109516/14 ; заявл. 18.03.2015 ; опубл. 20.05.2016.
  • 18F-FDG microPET imaging differentiates between septic and aseptic wound healing after orthopedic implant placement: a longitudinal study of an implant osteomyelitis in the rabbit tibia / J.C. Odekerken, B.T. Brans, T.J. Welting, G.H. Walenkamp // Acta Orthop. 2014. Vol. 85, No 3. P. 305-313. DOI: 10.3109/17453674.2014.900894.
  • A comparative 18F-FDG PET/CT imaging of experimental Staphylococcus aureus osteomyelitis and Staphylococcus epidermidis foreign-body-associated infection in the rabbit tibia / P. Lankinen, K . Lehtimaki, A.J. Hakanen, A. Roivainen, H.T. Aro // EJNMMI Res. 2012. Vol. 2, No 1. P. 41. DOI: 10.1186/2191-219X-2-41.
  • Phage therapy of staphylococcal chronic osteomyelitis in experimental animal model / C. Kishor, R.R. Mishra, S.K. Saraf, M. Kumar, A.K. Srivastav, G. Nath // Indian J. Med. Res. 2016. Vol. 143, No 1. P. 87-94. DOI: 10.4103/0971-5916.178615.
  • Разработка экспериментальной модели хронического остеомиелита : пат. 2622369 Рос. Федерация, МПК G 09 B 23/28 / Глухов А.А., Мику-лич Е.В., Новомлинский В.В., Андреев А.А., Шумилович Б.Р. ; заявитель и патентообладатель Микулич Елена Викторовна. № 2015153229 ; заявл. 11.12.2015 ; опубл. 14.06.2017.
  • Characterization of a rabbit model of staphylococcal osteomyelitis / M.S. Smeltzer, J.R. Thomas, S.G. Hickmon, R.A. Skinner, C.L. Nelson, D. Griffith, T.R. Parr Jr., R.P. Evans // J. Orthop. Res. 1997. Vol. 15, No 3. P. 414-421. DOI: 10.1002/jor.1100150314.
  • Способ моделирования остеомиелита : пат. 2578818 Рос. Федерация, МПК G 09B 23/28 / Доценко И.А., Чертков А.К., Котомцев В.В.; заявитель и патентообладатель Уральский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии. № 2014154473/14 ; заявл. 30.12.2014 ; опубл. 27.03.2016.
  • Способ моделирования хронической гнойной костной раны : пат. 2499295 Рос. Федерация, МПК G 09 B 23/28 / Митрофанов В.Н., Бобров М.И., Живцов О.П. ; заявитель и патентообладатель Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии. № 2012110364/14 ; заявл. 19.03.2012 ; опубл. 20.11.2013.
  • A rabbit osteomyelitis model for the longitudinal assessment of early post-operative implant infections / J.C. Odekerken, J.J. Arts, D.A. Surtel, G.H. Walenkamp, TJ. Welting // J. Orthop. Surg. Res. 2013. Vol. 8. P. 38. DOI: 10.1186/1749-799X-8-38.
  • The longitudinal assessment of osteomyelitis development by molecular imaging in a rabbit model / J.C. Odekerken, G.H. Walenkamp, B.T. Brans, T.J. Welting, JJ. Arts // Biomed. Res. Int. 2014. Vol. 2014. 424652. DOI: 10.1155/2014/424652.
  • Quantitative mouse model of implant-associated osteomyelitis and the kinetics of microbial growth, osteolysis, and humoral immunity / D. Li, K. Gromov, K. S0balle, J.E. Puzas, R.J. O'Keefe, H. Awad, H. Drissi, E.M. Schwarz // J. Orthop. Res. 2008. Vol. 26, No 1. P. 96-105. DOI: 10.1002/ jor.20452.
  • Comparative 18 F-FDG PET of experimental Staphylococcus aureus osteomyelitis and normal bone healing / J.K. Koort, T.J. Makinen, J. Knuuti, J. Jalava, H.T. Aro // J. Nucl. Med. 2004. Vol. 45, No 8. P. 1406-1411.
  • Способ моделирования хронического остеомиелита : пат. 2720838 Рос. Федерация, МПК A 61 B 17/56, G 09B 23/28 / Королев С.Б., Митрофанов В.Н., Живцов О.П., Юлина Д.П., Ковалишена О.В., Широкова И.Ю., Белянина Н.А. ; заявитель и патентообладатель Приволжский исследовательский медицинский университет. № 2019138548 ; заявл. 28.11.2019 ; опубл. 13.05.2020.
Еще
Статья научная