Моделирование и изучение антикоронавирусной активности производных 6,7-диметоксихиназолин-4(3H)-она в отношении SARS-CoV-2 методами in silico и in vitro

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice

Появление новой коронавирусной инфекции (COVID-19/SARS-CoV-2) в декабре 2019 года потребовало реализацию задач по поиску и созданию новых противовирусных препаратов. Глобальное распространение SARS-CoV-2 в совокупности с высоким количеством смертей побудило Всемирную организацию здравоохранения объявить пандемию 12 марта 2020 года [1]. За время пандемии погибло около 20 миллионов человек. В настоящее время на фармацевтическом рынке отсутствуют высокоэффективные лекарственные средств против данного инфекционного заболевания, соответственно это подчеркивает актуальность проблемы по разработки высокоэффективных и безопасных веществ против инфекции SARS-CoV-2 [2]. Значимыми мишенями в поиске соединений для терапии SARS-CoV-2 являются главная и папаино-подобная протеазы COVID-19, ингибирование которых приводит к нарушению жизнедеятельности вируса и его гибели [3].

Конденсированные и бензаннелированные производные пиримидина широко используются в медицинской практике для лечения различных заболеваний. В частности пиримидиновое ядро содержится в структурах различных противовирусных лекарственных препаратов [4], что объясняет целесообразность поиска новых противовирусных биологически активных соединений среди производных пиримидина. Например, синтезирована серия производных индоло[3,2-c]изохинолина (δ-карболина), некоторые из которых обладают противомикробным действием, а дальнейшее изучение этих структур in silico позволило предположить возможность ими ингибировать главную протеазу вируса COVID-19 [5]. In vitro установлено, что новые аналоги пиримидиновых тиогликозидов обладают активностью против штаммов вируса SARS-COV-2 и птичьего гриппа H5N1 [6]. Пиридо[2,3-d]пиримидины могут более эффективно ингибировать главную протеазу SARS-COV-2, чем препарат лопинавир, который обычно используется в качестве ингибитора вирусных протеаз [7]. Новые гетероциклические конденсированные системы содержащие фрагменты пиримидина и бензимидазола можно рассматривать в качестве ингибиров главной протеазы и спайкового гликопротеина SARS-CoV-2 [8]. Согласно данным in silico некоторые представители синтезированных нафтопирано[2,3-d]пиримидин-11(12H)-онов, могут обладать высоким сродством к сайту связывания главной протеазы коронавируса, что обуславливает их фармакологическое действие [9]. Таким образом, конденсированные гетероциклические производные пиримидина являются перспективным классом органических соединений для поиска новых биологически активных соединений с антикоронавирусной активностью. Среди методов прогнозирования биологической активности соединений in silico выделяют наиболее значимый и широко используемый метод молекулярного докинга. В ходе такого вычислительного эксперимента представляется возможным предположить энергии взаимодействия виртуальных структур с биологической мишенью и следовательно более обоснованно построить алгоритм исследования соединений in vitro и in vivo [10].

Материал и методы исследования

Объектами виртуального исследования выступают производные 6,7-диметоксихиназолин-4(3H)-она с остатками нейроактивных аминокислот и дипептидов [11]. Структурные формулы изучаемых соединений приведены на Рисунке 1 под шифрами 1с-13с.

Молекулярный докинг проводился в свободно распространяемой программе Autodock 4.0 [12]. Молекулярное моделирование осуществлялось с учетом конформационной подвижности лигандов, торсионные углы которых были установлены и заданы в данной программе. Заряды всех атомов моделируемой системы рассчитаны алгоритмом гастейгера (Gasteiger algorithm). В программе был задан поиск 200 энергетически выгодных конформаций образования молекулярного комплекса изучаемых соединений с белковой мишенью с использованием ламарковской скоринговой функцией подсчета энергии взаимодействия (Lamarckian GA 4.2). Расстояние между точками сетки составляло 0,375 ангстрема. Трехмерные модели рецепторов и ферментов для вычислительных экспериментов брали из базы данных виртуальных структур RCSB Protein Data Bank ( [13].

Виртуальные структуры моделируемых соединений были построены в программе HyperChem 8.0.4, а затем геометрически оптимизированы способом молекулярной механики с использованием метода MM+ [14]. Окончательная оптимизация геометрии виртуальных структур рассчитывалась в программе ORCA 4.1 с использованием теории функционала плотности (UB3LYP) и базового набора 6-311G**.

Преобразование формата hin в pdb, необходимого для молекулярного моделирования, было выполнено в программе Open Babel 2.4.1 [15].

1с; R = -C H , R = -CH -COOH

2c; R = -C H , R =-CH -C(O)-NH-CH -COOH

5c; R = -C H , R = -CH -COOH

6c; R = -C H , R = -CH -C(O)-NH-CH -COOH

3c; R1 = -C2H5, R

7c; R1 = -C3H7, R2

4c; R1 = -C2H5, R2 =

8c; R1 = -C3H7, R

9c; R1 = -CH(CH3)2, R2 = -CH2-C(O)-NH-CH2-COOH

11c; R = -CH ; R = -CH COOH

12 с ; R = Ph;  R = -CH COOH

13 с ; R = Ph;  R = -C H COOH

10c; R1 = -CH(CH3)2, R2 =

Рисунок 1. Структурные формулы прогнозируемых и далее синтезированных производных 6,7-диметоксихиназолин-4(3H)-она

Для прогнозирования противовирусной активности использовалась главная протеаза (идентификационный номер 7K6D [16]) и папаино-подобная (идентификационный номер 7LBR [17]) протеаза SARS-Cov-2. Областью вычислительного эксперимента для главной протеазы является куб, центр которого находится по следующим координатам: x = 9,664, y = 1,911, z = 22,528. Количество точек в измерениях по осям x, y и z равно 46. В случае папаиноподобной протеазы областью моделирования также является куб, центр которого находится по следующим координатам: x = 2,285, y = 14,435, z = 34,815. Количество точек в измерениях по осям x и z равно 46, а по оси y составляет 52.

Целенаправленный синтез наиболее перспективных прогнозируемых соединений выявленных in silico раннее был подробно описан в статье [11]. Соединения синтезировали взаимодействием соответствующих бензоксазинонов с глицином, глицилглицином, глициллейцином и глицилтриптофаном в среде ледяной уксусной кислоты при добавлении диметилформамида.

Оценку ингибирующей активности в отношении главной (Mpro) и папаино-подобной протеазы (PLpro) SARS-Cov-2 определяли путем проведения in vitro тестов [18, 19]. Для этого 20 мг исследуемого соединения растворяли в ДМСО до получения маточного раствора с концентрацией 1 мг/мл. Далее приготовляли серию двукратных разведений (растворитель — ДМСО) с конечным содержанием исследуемого соединения 500 µг/мл; 250 µг/мл; 125 µг/мл; 62,5 µг/мл; 31,25 µг/мл; 15,625 µг/мл и 7,8125 µг/мл. В микропланшет вносили 20 µМ Mpro или PLpro SARS-Cov-2 (Sigma-Aldrich) в объеме 10 µл, добавляли 10 µл раствора двукратных разведений исследуемого соединения. Полученную смесь инкубировали 10 минут при температуре 37 °С после чего в анализируемую среду вносили хромогенный субстрат и доводили до 200 µл буферным раствором 20 мМ HEPES рН 6,0 + 0,4 мМ ЭДТА+ 1 мМ дитиотреитол + 1% глицерин. Полученную смесь повторно инкубировали 60 минут в аналогичном температурном режиме. Параллельно ставили контрольную пробу и холостую пробу с водой для инъекций. Оптическую плотность полученных смесей регистрировали при 450 нм с использованием системы микропланшетного ридера Infinite F50 (Tecan, Австрия). Степень ингибирования ферментативной активности рассчитывали по разнице оптической плотности опытной/контрольной и холостой проб в %. На основании полученных результатов строили кривую зависимости «ингибирующая активность — logC» и рассчитывали коэффициент полуингибиции (IC50) в µМ/мл методом пробит-анализа. Все тесты выполнены в триплетном варианте с расчетом M±SEM (среднее ± стандартная ошибка среднего)

Результаты и обсуждение

С целью выявления достоверности вычислительного эксперимента связывания виртуальных структур с белковой мишенью осуществлялся расчет лиганд-ферментных комплексов классических ингибиторов протеаз и сравнение его с экспериментально полученными результатами рентгеноструктурного анализа описанными в научной литературе [16, 17]. В результате сравнительного анализа конформаций экспериментально определенных и теоретически рассчитанных лиганд-ферментных комплексов известных ингибиторов установлена достаточная достоверность используемого метода моделирования. Такой вывод вытекает из сравнения пространственное расположение референта телапревира в эксперименте in silico и экспериментально полученного рентгеноструктурным анализом, эта разница равняется 1,84 ангстремом (Рисунок 2), а для референтного вещества XR8-89 равняется 1,81 ангстрем (Рисунок 3). Эта разница меньше классически описанного предельного порога 3,0 ангстрем. Тем самым полученные результаты in silico эксперимента обладают достаточно высокой достоверностью.

Рисунок 2. Расположение телапревира в активном сайте главной протезы SARS-Cov-2. А — рентгеноструктурный анализ (зеленый цвет), Б — молекулярный докинг (розовый цвет)

Рисунок 3. Расположение XR8-89 в активном сайте папаино-подобной протезы SARS-Cov-2. А — рентгеноструктурный анализ (зеленый цвет), Б — молекулярный докинг (розовый цвет)

Наибольшее сродство к активному сайту главной протеазы SARS-Cov-2 показали производные 6,7-диметоксихиназолин-4(3H)-она с остатками глициллейцина и глицилтриптофан: 3c, 4c, 7c и 8c (Таблица 1). Максимальной устойчивостью лиганд-ферментного комплекса обладает вещество 2-пропил-6,7-диметокси-3,1-бензоксазин-4-она содержащее фрагмент глицилтриптофана (-9,38 ккал/моль, 8с). Особо следует отметить, что для наиболее перспективных структур (3с, 7с и 8с) представляется возможным формирование межмолекулярной водородной связи с Glu 166. На Рисунке 4 приведена наиболее устойчивая конформация соединения-лидера 8с в активном сайте главной протеазой SARS-Cov-2.

Таблица 1

ЗНАЧЕНИЯ ЭНЕРГИЙ ЛИГАНД-ФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА

И ДЛИН ВОДОРОДНЫХ СВЯЗЕЙ ПРОИЗВОДНЫХ

6,7-ДИМЕТОКСИХИНАЗОЛИН-4(3 H )-ОНА С ГЛАВНОЙ ПРОТЕАЗОЙ SARS-COV-2

Соединение	Энергия докинга, ккал/моль	Водородные связи
		Остаток аминокислоты	Группа лиганда	Длина водородной связи, Å
1c	-6,24	Gln192	COOH	1,731
2c	-7,75	Glu 166	COOH	2,055
		Gln 189	C=O	2,197
3c	-8,21	Glu 166	COOH	2,198
4c	-9,05	Gln 189	C=O	1,901
		Gln 192	COOH	2,095
5c	-6,20	Gln 189	C=O	2,124
6c	-7,22	—	—	—
7c	-8,59	Glu 166	COOH	2,225
8c	-9,38	Gly 143	OCH 3	2,189
		Glu 166	C=O	1,759
9c	-7,22	Gln 189	COOH	2,016
10c	-7,89	Gln 189	C=O	2,073
		Glu 166	COOH	1,173
11c	-6,13	Gln 192	COOH	2,227
12c	-6,81	Arg 188	C=O	2,185
13c	-7,03	Gly 143	COOH	2,252
		Glu 166	-N=	1,926

Рисунок 4. Расположение соединения 8с в активном сайте главной протеазы SARS-Cov-2

Как и в случае с главной протеазой наибольшее сродство к папаино-подобной протеазе SARS-Cov-2 прогнозируется для производных 6,7-диметоксихиназолин-4(3 H )-она с остатками глициллейцина и глицилтриптофана, вещества 4с, 7с и 8с (Таблица 2).

Таблица 2

ЗНАЧЕНИЯ ЭНЕРГИЙ ЛИГАНД-ФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА

И ДЛИН ВОДОРОДНЫХ СВЯЗЕЙ ПРОИЗВОДНЫХ 6,7-ДИМЕТОКСИХИНАЗОЛИН-4(3 H )-ОНА С ПАПАИНО-ПОДОБНОЙ ПРОТЕАЗОЙ SARS-COV-2

Соединение	Энергия докинга, ккал/моль	Водородные связи
		Остаток аминокислоты	Группа лиганда	Длина водородной связи, Å
1с	-5,22	Arg 166	-COOH	1,981
2с	-6,55	Asn 267	-COOH	2,135
		Tyr 268	-COOH	1,916
3с	-6,75	Tyr 268	-COOH	1,910
4с	-7,56	Trp 1	-СОNH-	1,984
5с	-5,67	Thr 301	-COOH	2,126
		Arg 166	-COOH	2,169
6с	-6,75	Tyr 268	-COOH	2,013
7с	-7,29	Gly 266	-COOH	2,053
8с	-8,82	—	—	—
9с	-6,52	—	—	—
10с	-6,86	Gln 269	-COOH	1,803
11с	-5,30	Tyr 268	-COOH	1,859
12с	-7,15	Thr 301	-COOH	2,007
13с	-8,11	Arg 166	-COOH	1,856
		Arg 166	COOH	2,041
Телапривир	-7,52	Arg 166	-N=	2,113

Однако структура 13с, содержащая остаток β-аланина, предположительно обладает соизмеримой энергией взаимодействия в сравнении с соединениями-лидерами (-8,11 ккал/моль, 13с). Экспериментальные исследования in vitro производные 6,7-диметоксихиназолин-4(3H)-она показали достаточно высокую способность ингибировать протеазы SARS-Cov-2 (Таблица 3). Наиболее выраженная активность наблюдается у вещества 8с, содержащего остаток глицилтриптофана. Причем согласно литературным данным, соединения-лидеры превосходят по активности известный препарат эбселен, для которого концентрация полумаксимального ингибирования для главной протезы приводится равная 0,67±0,09 мкМ/мл, а для папаиноподобной — 0,52±0,06 мкМ/мл [20].

ВЛИЯНИЕ ИССЛЕДУЕМЫХ СОЕДИНЕНИЙ

НА ИНГИБИРОВАНИЕ MPRO И PLPRO SARS-COV-2

Таблица 3

Соединение	IC50, мкМ/мл	Соединение	IC50, мкМ/мл
Ингибирование главной протеазы SARS-Cov-2
1c	0,09±0,008	8c	0,012±0,0048
2c	0,09±0,008	9c	0,098±0,0076
3c	0,1±0,007	10c	0,062±0,0004
4c	0,08±0,009	11c	0,046±0,001
5c	0,062±0,0015	12c	0,09±0,004
6c	0,081±0,0046	13c	0,1±0,007
7c	0,032±0,0087	эбселен	0,67±0,09 [20]

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice Т. 9. №8. 2023

Соединение	IC50, мкМ/мл	Соединение	IC50, мкМ/мл
	Ингибирование папаино	подобной протеазы SARS-Cov-2
1c	0,08±0,002	8c	0,013±0,0093
2c	0,07±0,004	9c	0,041±0,001
3c	0,07±0,004	10c	0,074±0,0038
4c	0,05±0,006	11c	0,023±0,002
5c	0,016±0,0006	12c	0,07±0,007
6c	0,025±0,0072	13c	0,1±0,003
7c	0,018±0,001	эбселен	0,52±0,06 [20]

В результате проведенного исследования осуществлено молекулярное конструирование и дальнейший целенаправленный синтез производных 6,7-диметоксихиназолин-4(3H)-она с остатками нейроактивных аминокислот и дипептидов обладающих антикоронавирусным действием. Полученные вещества следует рассматривать в качестве перспективных кандидатов для разработки новых противовирусных лекарственных средств. Предложенный алгоритм поиска инновационных противовирусных препаратов in silico достаточно хорошо согласуется с результатами эксперимента in vitro .

Финансирование: Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №20-315-90060.

Financing . The reported study was funded by RFBR, project no. 20-315-90060.