Моделирование in vitro молекулярных реакций мононуклеаров крови больных с наследственными коллагенопатиями на титановые имплантаты с модифицированной поверхностью

Для всех заболеваний, связанных с патологией коллагена, характерен высокий клинический полиморфизм. Большинство этих заболеваний проявляется в виде синдромов, являющихся выражением патологических процессов в отдельных ком-партментах соединительной ткани. Особенности клинического течения конкретного заболевания зависят от характера мутационного повреждения гена, определяющего биохимический дефект соответствующего коллагена.

В связи с этим наследственно обусловленные нарушения структуры и функции коллагена и связанные с ними многочисленные системные проявления объединяются в отечественной литературе термином «дисплазия соединительной ткани» (ДСТ). К настоящему времени описаны основные фенотипы явных диспластических синдромов (синдром Марфана, Элерса-Данло, несовершенный остеогенез).

Несовершенный остеогенез (НО) – наиболее распространенное наследственное заболевание соединительной ткани. Его частота в популяции составляет 1:10000 новорожденных и 1:1000 среди ортопедических больных. Клиническая картина НО характеризуется повышенной ломкостью костей и патологическими изменениями ряда других тканей, богатых коллагеном I типа, таких, как кожа, связки, хрящи, фасции, склеры, зубы, ткани среднего и внутреннего уха. При НО наблюдается чрезвычайно высокий клинический полиморфизм [11].

В настоящее время мутации, лежащие в основе развития различных моногенных наследственных заболеваний соединительной ткани, описаны для 24 коллагеновых генов, участвующих в синтезе 12 различных типов коллагенов, а также в трех генах ферментов биосинтеза коллагенов – PLOD1, PLOD2 и ADAMTS2. Более 260 различных мутаций известно для гена COL1A1 и более 130 для COL1A2. Уникальный характер генетических дефектов в сочетании с большим количеством коллагеновых генов и их сложной экзон-интронной структурой затрудняют молекулярную диагностику мутаций в каждом конкретном случае. Учитывая трудности идентификации точного молекулярного дефекта в каждом конкретном случае, рядом авторов [2] предлагается новый классификационный подход к ДСТ, который носит явно «прикладной» характер. Выделяются 3 фенотипа заболевания (марфаноподобный, элерсоподобный и MASS-фенотип). Это предложение заманчиво благодаря своей простоте и исходной идее о том, что несиндромные формы ДСТ являются «фенотипическими» копиями известных синдромов.

В предыдущей работе [6] нам удалось установить, что у больных с НО применение интрамедуллярного биоактивного остеосинтеза способствует кратковременной коррекции скелетных деформаций. С другой стороны, при использовании медицинских изделий развивается воспалительная реакция, активность и исход которой определяет во многом судьбу приживления или отторжения имплантата. Реакция модулируется не только местными стромальными элементами, но и циркулирующими во фракции мононуклеаров крови иммунными клетками. При этом основные события протекают на границе раздела   имплан- тат/биологическая структура [7].

В связи с этим, цель данного исследования провести in vitro сравнительную оценку молекулярной реакции культуры мононуклеарных клеток периферической крови здоровых добровольцев и больных коллагенопатиями на контакт с имплантатами, перспективными для совершенствования методов остеосинтеза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование включены 2 нозологические формы коллагенопатий несовершенный остеогенез (НО; 4 пациента, средний возраст 17 лет) и недифференцированная дисплазия соединительной ткани (ДСТ; 5 человек, средний возраст 18 лет). Пациентам с НО проводилась ортопедическая коррекция угловых деформаций нижних конечностей с использованием материалов с биоактивным кальцийфосфатным покрытием (регистрационное удостоверение Минздрава РФ № 29/12010200/1190-00 и сертификат соответствия ГОСТ Р № РОСС RU.АЯ 79.В55386). Все пациенты на момент забора биологического материала были соматически здоровы, после последнего хирургического вмешательства прошло от 2 месяцев до 1 года.

Диагноз “синдром ДСТ” был поставлен на основании полного физикального исследования с оценкой стигмального статуса, использования расчетных индексов и клинических тестов: тесты на наличие арахнодактилии и долихостеномелии, определение гипермобильности суставов по тесту Бейтона, плантографии. Диагностика степени тяжести ДСТ проводилась согласно критериям Милковска-Дмитровой и Каракашева в модификации Л.Н. Фоминой [5].

Мононуклеарные лейкоциты выделяли в стерильных условиях из периферической крови методом центрифугирования в течение 10 минут при 500 g с использованием градиента плотности Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция) (ρ=1,077 г/см3). Взвесь клеток (жизнеспособность более 95 %) культивировали в течение 52 часов при температуре 36 ºС в концентрации 5×106 нуклеаров/лунку в 1 мл полной культуральной среды, способствующей остеогенной дифференцировке клеток: 80 % среды ДМЕМ/F12 (1:1), 20 % эмбриональной телячьей сыворотки, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина сульфат, 10мМ бета-глицерофосфата, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты, 10-6 М декса- метазона, 10 мМ HEPES буфера.

Выделенные мононуклеары культивировались на пластике (контроль) или с добавлением стерильных титановых дисков с композитным покрытием кальцийфосфаты/полимер.

В качестве связующего компонента для изготовления композитов на титановых подложках был выбран биоинертный сополимер тетрафторэ-тилена с винилиденфторидом. Неорганической фазой композитных покрытий служил костный минерал биологического происхождения, полученный путем обжига свиных костей с последующим размолом, многократной промывкой, сушкой и просеиванием. Наличие гидроксилапатита в полученном материале доказано методом рентгенофазового анализа на дифрактометре Shimadzu XRD 6000. Раствор композита (соотношение компонентов 50:50) методом пневматического распыления наносили на предварительно подготовленные и нагретые до 70 °C титановые (ВТ-6) диски.

Супернатанты (кондиционные жидкости) получали путем забора надосадочной части клеточных культур, их центрифугирования в течение 10 минут при 500 g. В кондиционных средах методом ИФА реактивами Nordic Bioscience Diagnostics (Дания) оценивали маркеры костного ремоделирования (концентрации остеокальцина, продуктов деградации коллагена I типа (CrossLaps)), как описано ранее [6]. Кальций и неорганический фосфор измеряли колориметрическим стандартным методом, рекомендованным AACC и IFCC [3].

Концентрацию TNFα в супернатантах моно-нуклеарных клеток определяли с помощью наборов для ИФА производства «Вектор Бест» (Новосибирск) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Учет результатов проводили по калибровочной кривой с использованием фотометра для микропланшетов («Multiscan EX», USA).

Индивидуальную реакцию мононуклеаров различных людей на контакт с имплантатами определяли в процентном выражении от соответствующей реакции клеток на пластик. Статистическую обработку выполняли с применением программ «STATISTICA for Windows 6.0». Для описания изменчивости количественных признаков использовали общепринятые статистические процедуры, включая расчет параметров распределений (средние значения, их ошибки). Проверку на нормальность распределений осуществляли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. В выборках наблюдалось распределение показателей, отличное от нормального. В связи с этим, для оценки статистической значимости различий выборок применяли непараметрический критерий Вилкоксона (Т-тест). Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время активно изучается in vitro реакция клеток на искусственные поверхности [12]. Однако до сих пор получены неоднозначные результаты, тем более в условиях патологии клеточных систем. В связи с этим проведены сравнительные исследования молекулярной реакции культуры мононуклеарных клеток периферической крови у здоровых добровольцев, больных НО и ДСТ в условиях контакта с искусственным материалом.

Согласно обзору [10], в периферической крови человека обнаружена очень малая популяция (менее 0,5 клеток на 106 мононуклеаров) мульти-потентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), количество которых увеличивается при заболеваниях или методиках, вызывающих их мобилизацию из костного мозга.

Результаты наших исследований показали, что при контакте с имплантатами профиль маркеров костного метаболизма в супернатантах мононуклеаров, выделенных из крови здоровых добровольцев, свидетельствовал о некотором увеличении (табл. 1) уровней остеокальцина и CrossLaps по сравнению с культурой клеток на пластике с биоинертной поверхностью [7]. Существенный разброс полученных данных, связанный с индивидуальной нормой реакции, был отмечен нами ранее in vivo [4] и обусловил статистическую обработку результатов согласно Т-критерию Вилкоксона.

По-видимому, речь может идти об остеогенном созревании ММСК в культуральной среде, содержащей глицерофосфат и дексаметазон, как описано [9]. Действительно, результаты показали, что в остеогенной культуральной среде без дисков фибробластоподобная морфология отмечалась у 2,5 % мононуклеарных лейкоцитов, прилипающих к пластику. В то же время, в присутствии искусственных спутников (дисков) 1838 % мононуклеаров из периферической крови здорового человека претерпевали фибробласто-идную трансформацию.

В основе негативного влияния имплантата на организм лежит каскад событий, характерных для воспаления [8], развитие которых сопровождается продукцией медиаторов, вовлечённых в патологическую резорбцию костной ткани. Показано, что эти события приводят к развитию гра- нулематозной реакции со стороны окружающих тканей, активации мононуклеарных клеток к секреции цитокинов (в первую очередь, TNF-α) и протеолитических ферментов. Они стимулируют костную резорбцию, ингибируют костное образование, что может привести к расшатыванию имплантата, развитию асептического воспаления и локального остеопороза [7].

У здоровых добровольцев в супернатантах культуры мононуклеаров крови, взаимодействующих с искусственным материалом, более чем в 10 раз возрастала концентрация TNF-α (табл. 1), что может быть проявлением неспецифического адаптационного синдрома клеточных систем [1].

В свою очередь, в группе больных с НО и ДСТ имело место статистически значимое снижение секреторной реакции мононуклеаров крови на искусственный материал и показателей минерального обмена (табл. 1) на фоне увеличения доли фибробластоподобных клеток, прилипающих к пластику, до 4 – 14 % в сравнении с 2,5 % у здоровых добровольцев. Максимально выраженная морфологическая трансформация клеток отмечалась у пациентов с тяжелой клинической формой НО. В связи с этим, повышенный уровень остеокальцина, снижение кальция и фосфора в супернатантах клеток, полученных от больных НО, может свидетельствовать об усилении отложения минерального матрикса на имплантатах in vitro как отражение оперативных вмешательств в анамнезе больных.

В то же время, сниженная реактивность мо-ноцитарно/макрофагальных клеток крови у больных коллагенопатиями, зафиксированная по незначительной секреции TNF-α в кондиционных средах (табл. 1), является, по-видимому, благоприятным прогностическим признаком для хирургических вмешательств с использованием имплантационных материалов.

Исследование выполнено при поддержке гранта РФФИ №09-04-99105-р_офи “Создание и внедрение экспериментальной модели на основе смешанной культуры мононуклеаров периферической крови человека со стромальными стволовыми клетками для исследования механизмов, диагностики и терапии метаболических остеопатий человека“.

Таблица 1

Молекулярные показатели активности in vitro мононуклеаров крови (% от контроля на пластике) через 52 ч после контакта с имплантатами, несущими композитное покрытие кальцийфосфаты/полимер, Х±SD

Исследуемая группа	Изучаемые показатели в кондиционных средах культур клеток
	Остеокальцин	CrossLaps	TNF-α	Фосфор	Кальций
Здоровые добровольцы, n=5	116,67±42,36	141,94±130,65	1144,92±1073,41	161,22±86,57	168,82±59,69
Дисхондроплазия, n=5, *p<0,043	78,86±10,01	104,09±29,25	134,48±51,50	114,58±27,73	117,39±18,92
Несовершенный остеогенез, n=4, *p<0,05	178,30±151,55	82,19±66,38	135,46±65,63	92,28±2,38	84,84±7,72

Примечание: * – статистически значимые различия со здоровыми добровольцами согласно Т-критерию Вилкоксона; n – число обследованных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Моделирование in vitro молекулярной реакции мононуклеарных клеток периферической крови на контакт с имплантатами, перспективными для совершенствования методов остеосинтеза, может, на наш взгляд, применяться для индивидуальной оценки приживления/отторжения искусственного материала и его перспективности для хирургического лечения пациентов с НО и ДСТ.