Моделирование инфекционного процесса у личинок Galleria mellonella для оценки антибактериального действия катионных пептидных соединений в условиях in vivo

EDN: KHNKOH

Бактериальные инфекции являются серьезной проблемой здравоохранения из-за появления и распространения бактерий с множественной лекарственной устойчивостью [World Health Organization, 2022]. Данный факт обуславливает актуальность поиска и разработки новых противомикробных средств. Определение терапевтического потенциала новых соединений начинается со скрининга активности in vitro . При этом решающий этап взаимодействия пептида с мишенью происходит в модельной среде, которая сильно отличается от реальной среды живого организма. Мишени атакуемой микробной клетки имеют множество конформаций, на которые влияет окружающая среда. Все перечисленное может привести к расхождениям между активностью соединения в условиях in vitro и in vivo. Поэтому оценка антимикробной активности новых соединений или уже известных соединений, но с еще не установленными антибактериальными свойствами, является важным этапом исследования.

Личинки большой восковой моли ( Galleria mellonella ) в последние десятилетия широко используются в качестве модели для изучения инфекции и оценки антимикробной активности [Piatek, Sheehan, Kavanagh, 2020; Dinh et al., 2021]. Выбор данной модели, альтернативной позвоночным животным, обусловлен концепцией 3R об использовании позвоночных животных в научных экспериментах («Replacement, reduction and refinement of animal testing») [Гайдерова и др., 2025]. Помимо природных патогенных для G. mellonella микроорганизмов, таких как микромицеты Beauveria bassiana [Vertyporokh, Hułas-Stasiak, Wojda, 2020], личинки этих насекомых широко используются в качестве модели инфекций, вызываемых бактериями-патогенами человека и животных, а также для оценки эффективности новых противомикробных препаратов перед проведением доклинических исследований на млекопитающих [Asai et al., 2023; White, Sykes, Kumar, 2025]. При этом G. mellonella имеет ряд преимуществ перед моделями млекопитающих, поскольку не требует этического одобрения, легко поддается манипуляциям и имеет более низкую стоимость. Кроме того, личинки в большом количестве могут быть получены в лабораторных условиях, что обеспечивает быстрое проведение значительного количества экспериментов [Serrano et al., 2023].

Врожденная иммунная система G. mellonella неспецифична и является первой линией защиты от микробов, поддерживает гомеостаз и профилактирует инфекции. Она включает как клеточную (фагоцитоз, образование узелков и инкапсуляция), так и гуморальную защиту (меланизация, свертывание гемолимфы и производство антимикробных пептидов). Все перечисленное указывает на высокую степень структурного и функционального сходства с иммунной системой млекопитающих [Hoffmann, 1995]. Отсутствие адаптивного иммунитета у G. mellonella и других насекомых является преимуществом, поскольку позволяет изучать взаимодействие хозяина и патогена без вмешательства адаптивных ответов [Kavanagh, Sheehan, 2018]. Ввиду перечисленных свойств, личинки G. mellonella в настоящее время стали популярной моделью для изучения токсичности соединений и эффективности противомикробных препаратов in vivo , которые позволяют получить представление о вероятной дозе и потенциальном эффекте на млекопитающих [Hofkens et al., 2023].

Целью данной работы явилось моделирование инфекционного процесса у личинок большой восковой моли с последующим воздействием на них катионных пептидных соединений.

Материалы и методы

Объекты исследования . В работе использованы личинки восковой моли Galleria mellonella , которые были получены из учебно-научного центра «Экологии и морфофизиологии медоносной пчелы» ФГБОУ

ВО Пермский ГАТУ. В качестве инфекционного агента были использованы грамотрицательные бактерии Escherichia coli ATCC 25922, E. coli M-17, Pseudomonas fluorescens ATCC 948, а также грамположитель-ные бактерии Bacillus subtilis ATCC 6633, Listeria innocua M-2 и L. welshimeri Bel-19 (получены из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов «ГКПМ-Оболенск»). Для получения накопительных культур бактерии культивировали в жидкой питательной среде Luria Broth (LB) («Hopebio», Китай) в течение ночи при 37^оС, после чего клетки дважды отмывали в 10 мМ фосфатно-солевом буфере (рН 7.2), осадки суспендировали в питательной среде до ~10⁶–10⁸ КОЕ/мл. Количество колониеобразующих единиц в суспензиях определяли методом десятичных разведений и последующих точечных высевов на агаризованные чашки Петри [Веслополова, 1995].

Бабочки и личинки G. mellonella содержались при температуре 28–30°С в 3-литровых стеклянных банках, закрытых мелкоячеистой сеткой. В качестве корма использовали отработанные пчелиные соты. Использовали личинки массой 150–220 мг, для ряда экспериментов калибровали их по массе путем взвешивания на аналитических весах («Ohaus», Китай). За сутки до проведения эксперимента отобранные личинки выдерживали в термостате при 37^оС на искусственном субстрате следующего состава: мед (11 г), воск (11 г), глицерин (10 г), сухие дрожжи (10 г), отруби пшеничные (20 г), кукурузная мука (20 г), пшеничная мука (10 г), сухое молоко (10 г) [Коновалова, 2009]. Все компоненты за исключением сухого молока, подвергали стерилизации автоклавированием при 1 атм 30 мин [Осокина, Колбина, Гущин, 2016]. Распределение животных на группы по 10–20 личинок в каждой проводили методом слепой рандомизации.

В работе оценивали антибактериальное действие катионных соединений: пептидный антибиотик колистин (Sigma, США) и пептидное соединение сульфат протамина (1%, 850 ЕД/мл) (СОАО «Ферейн», Беларусь). Исходные растворы колистина и протамина концентрацией 0.1 мг/мл в деионизованной воде стерилизовали фильтрованием через нейлоновый фильтр с диаметром пор 0.22 мкм («Labfil® Economy Nylon», Китай).

Моделирование инфекционного процесса . Перед инфицированием гусениц помещали в чистые чашки Петри и выдерживали при 2–6^оС в течение 4 ч для обеспечения анестезии. После обездвиживания гусениц холодом им вводили по 10 мкл приготовленной суспензии бактерий. Введение бактерий проводили путем инъекции в левую последнюю ложноножку с помощью инсулиновых шприцев иглой 30G (0.3 мм) («BD» Micro-FinePlusDemiU-100», США). После инфицирования личинки переносили в стерильные чашки Петри и помещали в термостат при 37^оС. Для изучения влияния бактерий на развитие инфекционного процесса использовали личинки массой 150–220 мг, инфицированные суспензиями E. coli ATCC 25922, E. coli M-17, P. fluorescens ATCC 948, B. subtilis ATCC 6633, L. innocua M-2 и L. welshimeri Bel-19 в дозе 10⁵ КОЕ/личинку.

Для оценки влияния инфекционной дозы на выживаемость личинок использовали 3 группы из 10–20 личинок для каждого вида бактерий, которые инфицировали 10 мкл бактериальной суспензии, содержащей 1×106, 1×107 и 1×108 КОЕ/мл.

Исследование влияния массы личинок на их выживаемость после инфицирования бактериями E. coli ATCC 25922, L. innocua M-2 и L. welshimeri Bel-19 проводили на трёх группах личинок, отличающихся по массе (159±10, 185±4 и 210±7 мг), каждая из групп включала не менее 10 особей . После завершения испытаний все инфицированные личинки выводились из эксперимента путем помещения в морозильную камеру при –20 °C на 20–24 ч с последующим погружением в 96% раствор этилового спирта на 24 ч для дезинфекции.

Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) соединений . Определение чувствительности бактерий к исследуемым соединениям проводили методом последовательных двукратных микроразведений в 96-луночных полистироловых планшетах («Медполимер», Россия) [Определение чувствительности..., 2024]. В лунки планшета вносили по 100 мкл питательной среды Muller-Hinton (BD, США), затем в первую лунку ряда вносили 100 мкл раствора колистина или протамина с исходной концентрацией 0.1 мг/мл, и проводили серию двукратных разведений, после чего в каждую лунку добавляли по 10 мкл бактериальной суспензии, содержащей 10⁶ КОЕ/мл. Планшеты инкубировали в термостате при 37^оС 18–20 ч. По окончании инкубации в каждую лунку вносили по 10 мкл 2,3,5-трифенилтетразолия х. (ТТХ, 10 мг/мл) и инкубировали 20–30 мин до развития окраски, обусловленной метаболически активными клетками. За минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) соединения принимали наименьшую концентрацию исследуемого соединения, при которой не выявлялся видимый рост бактерий.

Определение лечебного эффекта соединений in vivo. Обработку личинок проводили через 1 ч после введения бактерий E. coli ATCC 25922, B. subtilis ATCC 6633 или L. innocua M-2 в дозе 105 КОЕ/личинка и 1 ч анестезии при 2–6оС путем инъекции раствора исследуемого соединения в объеме 10 мкл в правую последнюю ложноножку. Контрольной группе личинок вводили по 10 мкл буферного раствора. Наблю- дение за гусеницами осуществляли каждые 24 ч в течение 3 сут. После завершения испытаний инфицированные личинки выводились из эксперимента, как указано выше.

Статистическая обработка результатов . Все эксперименты были проведены в 3–5 кратной повторности. Статистическая обработка результатов проведена с помощью компьютерной программы «GraphPad Prism», при этом производили расчет средних значений и доверительных интервалов при p=0.05. Анализ выживаемости личинок G. mellonella проводили путем построения кривых Каплана – Мейера.

Результаты и их обсуждение

Влияние бактерий на выживаемость личинок G. mellonella . Известно, что у личинок G. mellonella после введения им некоторых бактерий развивается инфекционный процесс, который может заканчиваться гибелью личинок [Champion, Wagley, Titball, 2016; Asai et al., 2023]. В рамках настоящей работы проведен сравнительный анализ жизнеспособности личинок после воздействия грамотрицательных (двух штаммов E. coli и P. fluorescens ATCC 948) и грамположительных ( B. subtilis ATCC 6633 и Listeria spp.) бактерий (рис. 1).

Рис. 1. Выживаемость личинок G. mellonella после их инфицирования бактериями E. coli АТСС 25922, E. coli M-17, P. fluorescens ATCC 948, B. subtilis ATCC 6633, L. innocua М-2 и L. welshimeri Bel-19.

* – достоверное отличие от значения в 0 ч

[Survival of G. mellonella larvae after their infection with E. coli АТСС 25922, E. coli M-17, P. fluorescens ATCC 948, B. subtilis ATCC 6633, L. innocua М-2, and L. welshimeri Bel-19, * – significant difference from the value at 0 h]

Клетки всех исследованных штаммов, введенные в гемолимфу личинкам в количестве 10⁵ КОЕ/личинка, приводили к гибели G. mellonella (рис. 1). Примерно 50% личинок восковой моли, зараженных E. coli АТСС 25922 и P. fluorescens ATCC 948, погибало через 3 сут . Клетки E. coli М-17 были более вирулентными по сравнению E. coli АТСС 25922 и вызывали гибель всех личинок в выборке через 72 ч. Наиболее агрессивными для G. mellonella оказались грамположительные бактерии B. subtilis ATCC 6633, введение которых сопровождалось гибелью всех личинок уже через 24 ч после инфицирования. Динамика гибели личинок после инфицирования L. innocua М-2 и L. welshimeri Bel-19 была схожей и приводила к гибели примерно 40% особей в выборке через 72 ч.

После инфицирования у личинок G. mellonella наблюдалось изменение фенотипических признаков (рис. 2). У инфицированных личинок через несколько часов регистрировалось снижение подвижности и меланизация (потемнение), отсутствовало формирование коконов (рис. 2Б). Полностью меланизиро-ванные личинки, как правило, всегда погибали, однако меланизация концов тела (переднего и/или заднего) не всегда означала, что личинка погибнет.

Влияние инфицирующей дозы на выживаемость личинок G. mellonella . Согласно опубликованным исследованиям, инфицирующая доза для большинства изученных грамположительных и грамотри-цательных бактерий составляет от 1.5×10⁴ КОЕ/личинка до 10⁶ КОЕ/личинка [Chen, Keddie, 2021]. При этом установлено, что выживаемость бактерий напрямую зависит от дозы [Mukherjee et al., 2010; Hesketh-Best et al., 2021]. В настоящем исследовании также изучено развитие инфекционного процесса после введения различных доз исследуемых штаммов (рис. 3).

Рис. 2. Личинки G. mellonella до инфицирования (А) и через 18 ч после введения L. innocua М-2 (Б) [ G. mellonella larvae before infection (А) and 18 h after injection with L. innocua М-2 (Б)]

Г)

100---------

Время, ч

Время, ч

КОЕ/личинка

105 КОЕ/личинка

Рис. 3. Выживаемость личинок G. mellonella после их инфицирования бактериями E. coli АТСС 25922 (А), E. coli M-17 (Б), P. fluorescens ATCC 948 (В), B. subtilis ATCC 6633 (Г), L. innocua М-2 (Д) и L. welshimeri Bel-19 (Е) в различных дозах (10⁴–10⁶ КОЕ/личинка)

[Survival of G. mellonella larvae after their infection with E. coli АТСС 25922 (А) , E. coli M-17 (Б), P. fluorescens ATCC 948 (В), B. subtilis ATCC 6633 (Г), L. innocua М-2 (Д) и L. welshimeri Bel-19 (Е) in various doses (10⁴–10⁶ CFU/larva)]

10 КОЕ/личинка

В. subtilis АТСС 6633

Время, ч

105 КОЕ/личинка

106 КОЕ/личинка

L. welshimeri Bei-IQ

L. innocua М-2

Введение суспензии клеток E. coli M-17 в минимальной исследованной дозе приводило к гибели 20% личинок, при этом увеличение количества бактерий в 10 и 100 раз привело к полной гибели личинок через 72 ч и 24 ч после введения соответственно (рис. 3А). При этом другой штамм E. coli АТСС 25922 был менее вирулентным и не вызывал гибель личинок в дозе 10⁴ КОЕ/личинка (рис. 3Б). Дальнейшее увеличение количества вводимых бактерий приводило к более выраженному эффекту, так, введение 10⁶ КОЕ/личинка приводило к 90%-ной гибели через 48 ч. Динамика гибели личинок после введения

• P. fluorescens ATCC 948 была практически идентичной таковой после введения E. coli АТСС 25922 (рис. 3В), что согласуется с ранее проведенными исследованиями [Malmquist, Rogan, McGillivray, 2019; Chen, Keddie, 2021].

Инфицирование личинок клетками B. subtilis ATCC 6633 также приводило к гибели насекомых дозозависимым образом (рис. 3Г). Полная гибель личинок происходила через 24 ч после введения им суспензии бактерий B. subtilis ATCC 6633 начиная с дозы 10⁵ КОЕ/личинка. Снижение количества вводимых бактерий способствовало лучшему выживанию G. mellonella . Динамика гибели личинок после инфицирования L. innocua М-2 и L. welshimeri Bel-19 была сходной, при этом наблюдалась гибель 90% личинок после введения им листерий в максимальной исследованной дозе (10⁶ КОЕ/личинка) через 72 ч и 48 ч соответственно (рис. 3Д, Е). Снижение дозы вводимых бактерий в 10 раз приводило к выживанию 40% личинок. Согласно данным литературы, даже непатогенные штаммы листерий, такие как L. innocua , могут вызывать септическую гибель личинок большой восковой моли при высокой дозе инфицирования (10⁷ КОЕ/личинка), однако при меньших дозах (10⁶ КОЕ/личинка) бактериальные клетки могут быть связаны клеточными рецепторами, распознающими пептидогликан бактерий, что приводит к активации врожденной иммунной системы и элиминации бактерий [Mukherjee et al., 2010].

Влияние массы личинок на их выживаемость после инфицирования . Была проведена серия экспериментов по изучению устойчивости личинок к бактериальной инфекции в зависимости от их массы. С этой целью использовали выборки личинок восковой моли со средней массой 159±10, 185±4 и 210±7 мг, которые были инфицированы бактериями E. coli АТСС 25922, L. innocua М-2 и L. welshimeri Bel-19 в количестве 10⁵ КОЕ/личинка (рис. 4).

185±4 мг

20-

210+7 мг

159±10 мг

185+4 мг

й

□

Время, ч

Рис. 4. Выживаемость личинок G. mellonella различной массы после их инфицирования бактериями E. coli АТСС 25922 (А), L. innocua М-2 (Б), L. welshimeri Bel-19 (В)

[Survival of G. mellonella larvae of varying weights after their infection with E. coli АТСС 25922 (А), L. innocua М-2 (Б), L. welshimeri Bel-19 (В)]

159+10 мг

185±4 мг

210+7 мг

0-0

159±10 мг

210+7 мг

Введение грамотрицательных бактерий E. coli АТСС 25922 приводило к гибели личинок, причем наиболее чувствительными были личинки с наибольшей средней массой (210 мг) (рис. 4А). Личинки с меньшей массой были более жизнеспособны, при этом была отмечена гибель 75% личинок массой 185 мг через 72 ч после введения. Аналогичный эффект был ранее отмечен для личинок массой более 260 мг при инфицировании Staphylococcus aureus , в связи с чем было высказано предположение, что более крупные личинки старше и ближе к окукливанию, чем личинки меньших весовых групп [Jorjão et al., 2018; Hesketh-Best et al., 2021]. Для тутового шелкопряда было показано, что при развитии личинок наблюдаются существенные динамические метаболомные изменения в гемолимфе, которые затрагивают множество метаболических путей и могут влиять на иммунитет насекомых [Zhou et al., 2015].

Бактерии L. innocua М-2 (рис. 4Б) были более агрессивными для личинок восковой моли средним весом 159 и 210 мг, по сравнению с L. welshimeri Bel-19 (рис. 4В). Однако, в отличие от инфицирования E. coli , при введении листерий личинки со средней массой 210 мг показали наибольшую выживаемость по сравнению с личинками меньшей массы. Наиболее выраженный инфекционный процесс, вызванный бактериями рода Listeria , наблюдался у гусениц с наименьшей средней массой 159 мг, вызывая гибель 40–85% личинок. Показано, что голодание и, как следствие, снижение массы может снижать устойчивость G. mellonella к инфицированию из-за сокращения продукции внутриклеточных пептидов и количества циркулирующих гемоцитов [Banville, Browne, Kavanagh, 2012]. Кроме того, развитие инфекционного процесса зависит от объема циркулирующей жидкости и соответствующей бактериальной дозы [Andrea, Krogfelt, Jenssen, 2019].

Чувствительность бактерий к антимикробным пептидам . Для исследования антибактериального действия в условиях in vivo был выбран пептидный антибиотик колистин, относящийся к антибиотикам последнего резерва для лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями с множественной лекарственной устойчивостью [World Health Organization, 2022], а также катионный пептид протамин, являющийся специфическим антагонистом гепарина, у которого были обнаружены антибактериальные свойства [Ookubo et al., 2024]. Выбранные соединения были протестированы методом двукратных разведений в отношении E. coli АТСС 25922, B. subtilis ATCC 6633 и L. innocua М-2 для определения МИК. Все исследованные соединения обладали антибактериальной активностью в отношении исследованных бактерий в условиях in vitro (табл.). Грамотрицательные бактерии E. coli АТСС 25922 были более устойчивы к действию протамина, но обладали высокой чувствительностью к колистину, тогда как МИК протамина в отношении грамположительных культур было в 2–4 раза меньше, чем в отношении E. coli АТСС 25922.

Минимальные ингибирующие концентрации катионных соединений (МИК, мкг/мл) [Minimum inhibitory concentrations of cationic compounds (MIC, gg/ml)]

Бактериальные культуры	Колистин	Протамин
E. coli АТСС 25922	0.78	25
B. subtilis ATCC 6633	25	6.25
L. innocua М-2	25	12.5

Антибактериальное действие соединений в условиях in vivo . Антибактериальное действие ряда катионных пептидов было ранее протестировано в условиях модельного организма – восковой моли G. mellonella, по результатам которого эта модель показала надежные и воспроизводимые результаты [Hofkens et al., 2023]. Поэтому мы изучили действие колистина в отношении бактерий E. coli АТСС 25922, а также протамина в отношении бактерий B. subtilis ATCC 6633 и L. innocua М-2 после их введения личинкам G. mellonella (рис. 5).

E. co//ATCC 25922

B. subtilis ATCC 6633

Время, ч

Время, ч

Без лечения

Колистин

Без лечения

Протамин

Время, ч

Без лечения Протамин

Рис. 5. Выживаемость личинок G. mellonella после их инфицирования E. coli АТСС 25922 (10⁵ КОЕ/личинка) и введения колистина (0.78 мкг/личинку) (А), B. subtilis ATCC 6633 (Б) и L. Innocua М-2 (В) после введения протамина (6.25 и 12.5 мкг/личинка)

[Survival of G. mellonella larvae after their infection with E. coli ATCC 25922 (10⁵ CFU/larva) and treatment with colistin (2 μg/larva) (A), B. subtilis ATCC 6633 (B) and L. innocua M-2 (C) after the introduction of protamine (6.25 and 12.5 μg/larva)]

При введении колистина гусеницам, инфицированным E. coli АТСС 25922, уровень выживания личинок составлял 100% в течение всего периода наблюдения, тогда как без введения препарата наблюдалось снижение жизнеспособности на 30–60%. После инфицирования бактериями B. subtilis ATCC 6633 наблюдалась 100% гибель личинок, тогда как введение протамина способствовало выживанию 50% особей. Воздействие протамина на L. innocua М-2 в условиях in vivo также способствовало выживанию 70% особей в выборке, тогда как в отсутствие лечения наблюдалась гибель 90% личинок.

Заключение

В результате проведенных исследований установлено, что все исследованные бактерии вызывали инфекционный процесс у личинок большой восковой моли, при этом дозу введения необходимо регулировать в зависимости от вида и штамма бактерий. Кроме того, большое значение для анализа степени инфицирования личинок G. mellonella имеет средняя масса гусениц в выборке. Установлено, что катионные пептидные соединения (колистин и протамин) проявляют антибактериальное действие в условиях модельного организма в отношении протестированных штаммов бактерий, о чем свидетельствует повышение выживаемости инфицированных бактериями гусениц G. mellonella после введения им антибактериальных соединений.

Таким образом, использование личинок G. mellonella в качестве инфекционной модели для оценки эффективности антибактериальных соединений в условиях in vivo характеризуется относительной простотой и экономичностью анализа, что позволяет ускорить определение потенциальных терапевтических доз для млекопитающих при проведении доклинических испытаний новых противомикробных средств.