Моделирование интернализации водорастворимых противоопухолевых цитостатиков в тонкой кишке экспресс-методом ex vivo с помощью хемилюминесценции

В последние годы показана способность к всасыванию в тонкой кишке (интернализация) не только низко-, но и высокомолекулярных веществ [1–3]. В эксперименте моторную, секреторную и функцию всасывания веществ в кишечнике изучают на животных (крысы, кролики) в моделях изолированного отрезка кишечника (фистулы) по Тири – Велла, Тири – Павлову (с сохранением иннервации кишки) или традиционным методом в «остром» опыте по Уголеву. Последний многократно апробирован на различных животных и доказал свою результативность при исследовании процесса всасывания при использовании меченых соединений [4, 5]. Это позволяет определить уровень интернализации, что значимо для цитостатиков, предназначенных для доклинического изучения при пероральном введении.

Исследуемые агенты представляют собой противоопухолевые водорастворимые цито- статики, дающие конъюгаты с N-гидрокси-сукцинимидным эфиром акридина (Acridinium C2 NHS Ester, Toronto Research Chemicals, Canada; . Все агенты изучены доклинически при разных путях введения, способны в силу различных свойств или лекарственной формы (тонкокишечные капсулы) всасываться в кишечнике и рекомендованы для перорального введения. Среди них 2 высоко молекулярных белковых агента: таргетный нековалентный комплекс Аимпила, направленный на рецепторы α-фетопротеина (АФП), ингибитор апоптоза для введения в капсулах [5–7], и фермент L-лизин-α-оксидаза (ЛО), ингибитор синтеза белка с про-оксидантным действием, устойчивый к действию пищеварительных протеолитических ферментов [8–12]. В качестве низкомолекулярного препарата взят инновационный синтетический аналог антра-циклиновых противоопухолевых антибиотиков

Антрафуран. Он активен на опухолевых моделях парентерально и перорально и характеризуется комплексным механизмом антипролиферативной активности. Антрафуран – мультитаргетный ингибитор топоизомеразы I и II, а также ряда проте-инкиназ [13–15]. Это принципиально отличает его от единственного перорального антрациклинового антибиотика идарубицина (Заведос, Pfizer Pharma GmbH, Германия), монотаргетного ингибитора топоизомеразы II [16, 17].

Цель исследования – оценка всасывания в тонкой кишке новых водорастворимых противоопухолевых цитостатиков с различными свойствами для доклинического изучения при пероральном введении.

Материал и методы

Животные. Использовано 11 здоровых беспородных половозрелых крыс-самок массой тела 150–200 г из питомника «Крюково», которых содержали в виварии НМИЦ при конвенциональных условиях. Для проведения эксперимента наркотизированным крысам 0,5 мг/кг золетилом ( Virbac, Франция) выполняли аутопсию и выделяли для каждого конъюгата изолированные отрезки тонкой (тощей) кишки длиной 3–5 см из 3–4 крыс, после чего крыс умерщвляли передозировкой эфирного наркоза.

Подготовка системы . Для подготовки к опыту каждый отрезок промывали теплым раствором Рингера – Локка (37 °С) и затем быстро выворачивали для обнажения внутренней части слизистой оболочки. Один край «вывернутого» отрезка пережимали пластмассовой клипсой, заливали в полость 0,2–0,4 мл теплого раствора Рингера (инкубационная среда, ИС; incubation medium, IM ), после чего пережимали второй конец отрезка аналогичной клипсой и помещали в емкость с ИС. Емкость с фиксированными отрезками кишки выдерживали 30 мин на шейкере, помещенном в термостат (37 °С) при постоянном перемешивании ИС для сохранения моторики кишки (рис. 1).

Уровень люминесценции в ИС измеряли до (начальный неспецифический сигнал) и после (исходный специфический сигнал) внесения тестируемых конъюгатов в различных исходных концентрациях. Через 30 мин инкубации отрезки кишки извлекали из ИС, трехкратно отмывали в теплом растворе Рингера – Локка, t=37°C и определяли уровень люминесценции в смыве с наружной стенки кишки для контроля оставшегося люминесцентного сигнала. После этого отбирали пробы (n=3–4) по 0,2 мл содержимого внутренней части изолированных «вывернутых» отрезков тонкой кишки для измерения специфического сигнала биоконъюгата, прошедшего через слизистую поверхность кишки. Эксперименты с животными проводили в соответствии с требованиями Женевской Конвенции «International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals» (Geneva, 1990).

Оценка трансэпителиального переноса конъюгатов через стенку тонкой кишки. Измерения были выполнены на микропланшет-ном ридере флэш-хемилюминометре Glomax 96 («Promega», США) по сигналу, вызванному реакцией окисления люминофора 4-(2-сукцинимидил-оксикарбонилэтил)-фенил-10-акридин-9-карбоксилат три-флюорометил сульфонат ( 4-(2-Succinimidyloxy-carbonylethyl)-phenyl-10-acridinium-9-carboxylate Trifluroro-methyl Sulfonate, MW 0,63 кДа, Toronto Research Chemicals, Канада), конъюгированного с исследуемыми препаратами. Специфические характеристики измерения на люминометре: объем образца 50 мкл/лунку; активатор 1N NaOH 50 мкл/лунку; задержка между считыванием соседних лунок 1 сек; время интеграции сигнала 1 сек; время накопления сигнала 1 сек. Уровень люминесценции конъюгата определяли с помощью относительных световых единиц ( relative light units, RLU), одна единица RLU равна одному фентомолю (10^–15 М) АТФ. Среднее арифметическое значение.

Рис. 1. Подготовка системы «вывернутых» изолированных отрезков тонкой кишки крысы к исследованию: слева – выделение участка кишки у наркотизированной крысы; справа – термостатируемая система для изучения интернализации веществ в кишечнике

Расчет процента интернализации конъюгата. Значение RLU в образцах ИС после внесения каждого конъюгата принимали за 100 %. Через 30 мин по средним арифметическим значениям RLU, полученным от образцов внутреннего содержимого всех отрезков тонкой кишки, рассчитывали процент интернализации каждого конъюгата на 1 см и затем на всю длину кишки по формуле

[RLU(I)/RLU(HC)]x 100% _ %RLU

L(Z)

,

CM

где RLU(ИС)– значение люминесцентного сигнала ИС сразу после внесения конъюгата;

RLU(Σ) – сумма значений RLU от содержимого всех отрезков тонкой кишки крысы (n=3–4) через 30 мин после внесения конъюгата;

L(Σ)– длина всех отрезков кишки (см) в системе одного конъюгата;

Lк– длина всей кишки (110 см);

%RLU/см – процент конъюгата, который переносится через 1 см кишки за 30 мин;

%RLU(Σ) – процент конъюгата, который переносится через всю длину кишки за 30 мин.

Все манипуляции выполнены в соответствии с описанной модифицированной методикой [1].

Исследованные цитостатики и их конъюгаты с Акридином

Аимпила (MW 72 кДа) – нековалентный комплекс свиного АФП и индуктора апоптоза гликозида Атрактилозида из Atractylis Lancea получен от ООО «ФармАксесс» (Москва) в лиофилизированном виде. По результатам доклинических исследований препарат Аимпила показал эффективность при пероральном введении и рекомендован для применения в тонкокишечных капсулах [6, 7]. Конъюгат Аимпила-Акридин (MW 105 кДа) готовили по методике Р. Моро [5]. Связывание относительно небольших молекул Акридина MW 0,6 кДа с белком происходит через аминогруппу, т.е. по 55 молекул Акридина на 1 молекулу Аимпила. Концентрацию всех конъюгатов измеряли в оригинальном неразбавленном виде по методу Брэдфорда или Лоури, после разбавления ее пересчитывали с учётом фактора разбавления. Концентрация конъюгата Аимпила-Акридин после разбавления в ИС составила 1,0 мкг/мл.

Lлизин-α-оксидаза (ЛО) – фермент (MW 120 кДа, удельная активность 55 Е/мг белка), ЛО получен в лиофилизированном виде [11 ] . ЛО э ффективна при парентеральном введении при 5-кратном введении в дискретном режиме со стартовой разовой дозой 400 Е/кг, эмпирические пероральные дозы не определены [9–11]. Устойчивость ЛО в концентрации 0,17 мкМ к действию протеолитических ферментов определена в присутствии трипсина (21,7 мкМ) и химотрипсина (20 мкМ) при инкубировании (37 ^оС) в содержащем 0,02 М CaCl₂0,1 М трис–HCl буфера (pH=8,0), ошибка определения активности

ЛО <3% [9]. Конъюгат ЛО-Акридин (MW 122 кДа) готовили по той же методике [5]. Концентрация конъюгата определена по методу Брэдфорда и после разбавления в ИС составила 23 мкг/мл.

Антрафуран (MW 0,502 кДа) – метансульфонат (S)-3-[(3-амино-1-пирролидинил)карбонил]-4,11-дигидрокси-2-метилантра[2,3-b]фуран-5,10-дион, производное антра[2,3-b]фуран-3-карбоксамида, получен в виде оранжевого мелкодисперсного порошка по методу [13]. Максимальные эффективные разовые дозы для мышей с опухолями определены эмпирически: парентеральная <50 мг/кг, пероральная <100 мг/кг [14, 15].

Конъюгат Антрафуран-Акридин (MW 0,8 кДа) готовили из лиофилизованного Антрафурана, нагревая 100 ммоль/л раствор в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) 10 мин на водяной бане при 80 °С. Затем к 800 мкл (400 мкг) раствора Антрафурана добавили 100 мкл ДМСО и 50 мкл раствора эфира Акридина в ДМСО (5 мг/мл) и смешали на во-ртексе без образования пены. Инкубировали при комнатной температуре 20 ч в защищенной от света пробирке. Осадок центрифугировали 10 мин при скорости 10 000 об/мин и отмывали 4-кратно от свободного Акридина, затем растворяли в 1 мл 100 мМ ФСБ. Хранили при 4 °С в защищенной от света пробирке до добавления в ИС. Концентрация конъюгата Антрафуран-Акридин была определена по методу Брэдфорд и после разбавления в ИС составила 2 мкг/мл.

Результаты

Уровень неспецифической люминесценции ИС без метки (до добавления конъюгатов) предельно мал и составляет 6–65 RLU (табл. 1, 2). Сигнал из смыва с наружной поверхности кишки также был минимальным – от 50 до 157 RLU. Следовательно, начальный и конечный сигналы были не существенны для оценки результатов всасывания конъюгатов.

Уровень люминесценции ИС после добавления 1,0 мкг/мл Аимпила-Акридина составил 1073714 RLU. Через 30 мин инкубации в просвете «вывернутых» отрезков тонкой кишки уровень люминесценции достиг диапазона 425–829 RLU. Всасывание на 1 см кишки составило 0,015 %, а на всю длину кишки крысы (110 см) – 1,7 %.

Уровень люминесценции ИС после добавления ЛО-Акридин в исходной концентрации 23 мкг/мл составил 814590 RLU. Через 30 мин инкубации в просвете «вывернутых» отрезков тонкой кишки уровень люминесценции оказался в диапазоне 2500–3540 RLU. Рассчитанная всасываемость конъюгата ЛО-Акридин на 1 см каждого отрезка тонкой кишки составила 0,1 %, для всей тонкой кишки крысы длиной 110 см – 11 %.

Уровень люминесценции ИС после добавления 2,0 мкг/мл Антрафуран-Акридин составил 2339836 RLU. Через 30 мин инкубации в просвете

Таблица 1

Люминесцентный сигнал в содержимом изолированных отрезков тонкой кишки крыс через 30 мин после внесения конъюгированных с Акридином цитостатиков в ИС

		Значение RLU
	Образец	Конъюгаты	в исходной концентрации (мкг/мл)
		АИМПИЛА-Акридин (1,0)	ЛО-Акридин (23,0)	Антрафуран-Акридин (2,0)
Инкубационная	До внесения метки***	30	6	65
среда**	После внесения конъюгата	1073714	814590	2339836
Содержимое отрезка тонкой кишки (3–5 см)	№1	829	2530	4534
	№2	425	3440	2396
	№3	740	3020	4720
	№4	649	3540	-
Смыв с наружной поверхности тонкой кишки крысы		50	72	157

Примечание: RLU (relativelight units) – относительные световые единицы, ** – раствор Рингера – Локка; *** – неспецифический сигнал.

Таблица 2

Всасывание конъюгированных с Акридином цитостатиков с разной молекулярной массой из тонкой кишки крысы

Конъюгат	Молекулярная масса (кДа)	Молекулярная концентрация в ИС (нмоль/л)	% всасывания из кишки за 30 мин
АИМПИЛА-Акридин*	105	9,2	1,7
ЛО-Акридин	122	188,0	11,0
Антрафуран-Акридин	0,8	2500,0	55,0

Примечание: * – MW Акридина 0,630 кДа (Acridinium C2 NHS Ester, Toronto Research Chemicals, Канада).

«вывернутых» отрезков тонкой кишки уровень люминесценции достиг диапазона 935–4534 RLU. Всасывание на 1 см кишки составило 0,5 %, а на всю длину кишки крысы (110 см) – 55 %. Отсутствие корреляции между концентрацией и интенсивностью сигнала Антрафуран-Акридина связано с индивидуальными особенностями каждой молекулы.

Рассчитанное по люминесцентному сигналу всасывание из всей тонкой кишки крысы было различным и возрастало в зависимости от молярной концентрации изученных конъюгатов. Видно, что минимальное всасывание на уровне 1,7–11 % демонстрируют конъюгаты высокомолекулярных цитостатиков при молярной концентрации 9,2–188 нмоль/л. Максимальное всасывание на уровне 55 % показал низкомолекулярный конъюгированный Антрафуран при молярной концентрации 2500 нмоль/л (табл. 2).

Для конъюгата Антрафурана уровень всасывания в 55 % согласуется с величиной пероральной дозы 100 мг/кг, установленной при доклиническом изучении на животных с опухолью, которая была в два раза больше эквитерапевтической парентеральной дозы ~50 мг/кг [15]. Это дает основание считать, что уровень интернализации конъюгата может быть использован для прогнозирования стартовой пероральной дозы цитостатика.

Заключение

Сочетание модифицированной методики изолированного «вывернутого» отрезка тонкой кишки крысы и импульсной хемилюминесценции в экспресс-методе ex vivo моделирует интернализацию в организм различных водорастворимых противоопухолевых цитостатиков. Уровень всасывания конъюгированных с Акридином цитостатиков c молекулярной массой от 0,8 кДа до 122 кДа варьирует от 55 до 1,7 % в зависимости от молярной концентрации от 2500 до 9,2 нмоль/л соответственно. Уровень всасывания Антрафурана (55 %) согласуется с соотношением эквитерапевтических разовых доз при пероральном введении: 100 мг/кг против 50 мг/кг. Полученные данные позволяют рассматривать экспресс-метод ex vivo в качестве скринингового для выявления возможности доклинического изучения различных противоопухолевых цитостатиков при пероральном введении с прогнозированием стартовой дозы. Метод хорошо согласуется с тестами in vivo и экономически целесообразен в силу быстрого ответа и малого количества тестируемого агента.