Моделирование острого легочного повреждения путем ингаляции ультрадисперсных аэрозолей бактериального липополисахарида

Бактериальные липополисахариды (далее – ЛПС) являются уникальными молекулами, обладающими широким спектром биологических эффектов в отношении клеток многих органов и тканей теплокровных при попадании в их организм. Эндогенный ЛПС, посту-

пающий в кровоток из кишечника в небольших концентрациях, является одним из естественных регуляторов иммунитета. При появлении в организме в больших концентрациях за счет своей способности активировать выброс цитокинов макрофагами (далее – МФ), воздействия на эндотелий и паренхиматозные клетки некоторых органов ЛПС способен вызывать мест- ные повреждения тканей и системные реакции, вплоть до септического шока [2; 3; 14].

Последствия ингаляционного поступления ЛПС в организм изучены в наименьшей степени. Специфика токсического повреждения легких обусловлена их структурно-функциональными особенностями, значительными объемами транзита атмосферного воздуха и крови, а также высоким представительством клеток, имеющих рецепторы к ЛПС (CD14, TLR4) и секретирующих биологически активные вещества в ответ на контакт с ним [9; 11; 15].

Интенсивность тканевых изменений в легких варьируется в зависимости от дозы поступающего ЛПС и кратности воздействия. Для острого процесса характерно цитокинза-висимое повреждение эндотелия и эпителиальной выстилки межальвеолярных перегородок, повышение сосудистой проницаемости и накопление экссудата, в том числе и полиморфно-ядерных лейкоцитов, в альвеолярных пространствах. Эта картина по морфологии описывается как «острое легочное повреждение», при максимальной выраженности – как респираторный дистресс-синдром взрослых, или «шоковое легкое» [1; 6; 8; 12].

При ингаляции малых доз бактериального ЛПС развивается повреждение по типу субхронического бронхоальвеолита, сопровождающееся частичной деструкцией бронхиального эпителия и альвеолоцитов, реакцией альвеолярных и бронхиальных МФ, снижением воздушности легких при умеренно выраженной бронхиальной экссудации [2; 5; 7]. Подобная картина повреждения легких описана у людей, имеющих профессиональный контакт с аэрогенной формой ЛПС, – работников мясокомбинатов, парниковых хозяйств и ряда подобных предприятий [10; 13].

Основные модели ингаляционного повреждения легких, применяемые на сегодняшний момент в экспериментальной биологии и медицине [1; 6; 7], исходят из того, что аэрозольная дисперсия ЛПС при спонтанном вдохе практически полностью оседает и обезвреживается в верхних дыхательных путях. В связи с этим для исследования эффектов ЛПС на альвеолярный аппарат легких в основном используется интратрахеальное введение токсина, что достаточно трудоемко. Использование ультрадисперсных аэрозолей может обеспечить лучшую доставку ЛПС к клеткам межальвеолярных перегородок и сделать модель ингаляционного ЛПС более адекватной и доступной в исполнении.

Цель работы – изучить основные эффекты ЛПС при его ингаляционном поступлении в организм в виде ультрадисперсного аэрозоля как доказательство биологической адекватности данной модели острого легочного повреждения.

Материалы и методы

Эксперимент проводили на 24 нелинейных белых крысах породы «вистар» массой от 220 до 240 г в соответствии этическими нормами, изложенным в Международном кодексе медицинской этики (1994), Хельсинской декларации (2000) и Директивах Европейского сообщества 86/609EEC. Животных разделили на две группы. В опытной группе 18 животных помещали на 1 ч в затравочную камеру, содержащую 100 л воздуха в смеси с водно-солевым аэрозолем ЛПС Escherichia coli О128 : B12 (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA). Микроаэро-зольные капли со средним диаметром 4 мкм, содержащие ЛПС, получали с помощью компрессорного ингалятора CN-231 (Japan). Частицы такого размера способны свободно проникать не только в верхние дыхательные пути, но и в альвеолярный аппарат легких крысы в процессе спонтанного дыхания. Условия опыта были подобраны так, что за время нахождения в камере каждое животное инспирировало ЛПС в дозе порядка 1 мг/кг массы. По 6 животных опытной группы вывели из эксперимента через 3, 8 и 24 ч после ингаляции передозировкой «Золетила» (120 мг/кг массы). Контрольную группу составили 6 крыс, которые находились в обычных условиях вивария без каких-либо воздействий и были выведены из эксперимента в те же сроки.

Забор крови у выбранных животных осуществляли стерильной иглой из подъязычной вены. Тканевые гомогенаты легких приготавливали предварительно простерилизованными (60 мин при 210 °С) инструментами и посудой, используя апирогенный фосфатный бисо-левой буфер с pH 7,20. Весь забранный материал фракционировали на микроцентрифуге ScanSpeed mini BLUE (Denmark) в течение

15 мин при 3 000 об/мин (сыворотка крови) или 13 500 об/мин (тканевые гомогенаты легких).

Концентрацию ЛПС определяли в надосадочной жидкости турбидиметрическим методом с использованием ЛАЛ-реактива Pyrotell-T (Associates of Cape Code inc., USA) на микропланшетном ридере Bio-Rad (iMark, Japan). В сыворотке крови концентрацию выражали в нг/мл жидкости, в тканевых гомогенатах легких – в нг/г полусырой массы органа.

Для патоморфологического анализа кусочки легких размером 5 x 10 x 10 мм фиксировали в течение 48 ч в 10%-м растворе нейтрального формалина. После фиксации и заливки в парафин с блоков готовили срезы толщиной 5–7 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином по общепринятой методике [2]. Исследование и оцифровку микропрепаратов проводили на микроскопе БИМАМ Р-13 (ЛОМО, Россия) с фотокамерой TK-C620E JVC (Japan). Для морфометрического исследования использовали автоматическую систему обработки изображений «Видеотест-Морфо 3.0» (Россия). Рассчитывали объемные доли (%) воздуха альвеол, бронхиального экссудата, поверхностные плотности эпителиоцитов бронхов и альвеоци-тов (1/мм²).

Иммуногистохимическое исследование проводили на срезах с тех же парафиновых блоков с использованием реактивов компании DakoCytomation (Дания). Визуализацию проводили с помощью непрямого иммуноперок-сидазного метода с высокотемпературной и ферментной демаскировкой антигенов, использовали позитивные и негативные контро-ли антигенов, а также негативные контроли антител. Численную плотность бронхиальных и альвеолярных МФ (1/мм3), а также интенсивность макрофагальных реакций оценивали при визуализации CD68-позитивных клеток. Моноклональные антитела к десмину (клон D33), помимо миоцитов стенок бронхов и сосудов, позволяли маркировать миофибробласты межальвеолярных перегородок и, таким образом, отслеживать инициальные моменты фиброгенеза в ткани легких после их токсического повреждения. Использование антител к альфа-антитрипсину позволяло выявить тканевое распределение и клетки-источники этой антипротеазы, играющих существенную роль в инактивации протеолитических ферментов, а также балансе цитокинов и гормонов пептидной природы в тканях легких.

Обработку количественных данных проводили непосредственно из общей матрицы данных Excel 7.0 (Microsoft, USA) с привлечением возможностей программ Statistica 6.0 (StatSoft Inc., USA), с учетом общепринятых требований для медико-биологических исследований. Для анализа различий между выборками использовали критерий Манна-Уитни.

Результаты и их обсуждение

Ингаляция бактериального ЛПС сопровождалась повышением его концентрации в тканях легких через 3 ч в 18,2 раза (P < 0,001) с последующим постепенным уменьшением. К 8 ч после ингаляции концентрация ЛПС в ткани легких превышала величину показателя у крыс контрольной группы в 3,35 раза (P < 0,01), а к 24 ч с начала эксперимента – практически нормализовалась. При исследовании сыворотки крови, в которой у животных контрольной группы обнаруживалась лишь следовая концентрация ЛПС, удавалось зафиксировать незначительное повышение содержания ЛПС к 3 ч эксперимента. Это свидетельствовало в пользу исключительно ингаляционного поступления токсина в ткани легкого и одновременно не позволяло рассматривать данное состояние как системную эндотоксемию (см. табл. 1).

К 3 ч после ингаляции ЛПС в легких животных морфологически регистрировали признаки острого токсического повреждения. Просветы бронхов были большей частью свободными с небольшим количеством слущенного эпителия, слизисто-белкового экссудата и лейкоцитов, преимущественно лимфоцитов и МФ.

Со стенок бронхов эпителий был местами десквамирован, сосуды их стенки были расширены, периваскулярно наблюдались скопления МФ и лимфоцитов. Часть альвеол была эм-физематозно расширена до разрывов со слиянием соседних альвеол, часть – с уменьшенным просветом за счет увеличения объема межальвеолярных перегородок. Подобный дис-телектаз был обусловлен неравномерным утолщением межальвеолярных перегородок в результате их отека, лейкоцитарной (преимущественно – лимфоцитарной) инфильтрации и пол- нокровия микроциркуляторного русла, но просвет большинства альвеол был чист. В части кровеносных капилляров обнаруживались скопления агрегатов эритроцитов.

Через 8 ч после ингаляции просветы бронхов были большей частью свободными, но их эпителий десквамирован на протяжении, в отдельных бронхах обнаруживались до 30 % диаметра скопления белкового экссудата, окруженного полиморфно-ядерными лейкоцитами, и слу-щенный эпителий. Местами в стенке бронхов фиксировались явления эритро- и лейкодиапеде-за, активные скопления МФ. Выявлялось резкое утолщение межальвеолярных перегородок за счет их отека и лимфоцитарной инфильтрации, полнокровие микроциркуляторного русла, диапедез-ные кровоизлияния вокруг сосудов. Повсеместно, но более под плеврой, обнаруживались небольшие фокусы ателектаза. Часть альвеол была эмфизематозно расширена, в просвете других выявлялся белковый экссудат со значительным количеством клеток, в том числе и МФ. Эпителий альвеол находился в состоянии дистрофии и час- тично отслаивался. Нейтрофильные и лимфоцитарные инфильтраты в отечных межальвеолярных перегородках были весьма многочисленны. Наблюдалась ярко выраженная реакция альвеолярных МФ в виде увеличения их размеров, вакуолизации цитоплазмы и формирования скоплений в межальвеолярной перегородке. В части кровеносных капилляров просвет был спавшимся, в других – резко расширенным и заполненным агрегированными эритроцитами.

Морфология ткани легких в период между 8 и 24 ч существенно не различалась. Достоверных признаков активации фиброгенеза в легких, с учетом продолжительности эксперимента, ни в одном случае не наблюдали.

Полученные данные свидетельствуют о том, что ингаляция ЛПС сопровождается яркими изменениями со стороны паренхимы легких, основу которых составляют сосудистые и клеточные реакции.

Количественные показатели легочного повреждения при ингаляционном поступлении ЛПС приведены в таблице 2.

Таблица 1

Концентрация бактериального липополисахарида в тканях легких и сыворотке крови белых крыс после его 1-часовой ингаляции в виде ультрадисперсного аэрозоля, M ± m

Материал	Контрольная группа	Опытная группа
		3 ч	8 ч	24 ч
Ткани легких	2,45 ± 0,38	44,71 ± 2,70 *	8,20 ± 1,15 *	3,22 ± 0,27
Сыворотка крови	Следы (<0,025)	0,34 ± 0,05 *	Следы (<0,025)	Следы (<0,025)

Примечание. * – достоверные различия с величиной показателя в контрольной группе.

Таблица 2

Показатели морфометрии легочной ткани крыс при ингаляции бактериального липополисахарида в виде ультрадисперсного аэрозоля, M ± m

Показатели	Контрольная группа	Опытная группа
		3 ч	8 ч	24 ч
Объемная доля бронхиального экссудата, %	0,6 ± 0,1	3,7 ± 0,2 *	4,3 ± 0,2 *	2,5 ± 0,1 *
Поверхностная плотность эпителия бронхов, 1/мм2	9 864 ± 429	9 203 ± 379 *	7 558 ± 326 *	7 411 ± 357 *
Численная плотность бронхиальных макрофагов, 1/мм3	474 ± 19,3	560 ± 26,3	771 ± 39,8	801 ± 44,5
Объемная доля воздуха альвеол, %	60,2 ± 2,6	45,1 ± 2,1 *	36,1 ± 2,3 *	31,0 ± 1,8 *
Поверхностная плотность альвеоцитов, 1/мм2	8 432 ± 313	6 805 ± 489 *	6 028 ± 318 *	5 251 ± 283 *
Численная плотность альвеолярных макрофагов, 1/мм3	163 ± 9,3	366 ± 15,8 *	412 ± 18,8 *	447 ± 20,1 *

Примечание. * – достоверные различия с величиной показателя в контрольной группе.

Объемная доля бронхиального экссудата увеличивалась за время эксперимента более чем семикратно, достигая максимума через 8 ч с момента ингаляции ЛПС и несколько снижаясь к 24 ч (все P < 0,001). Следовательно, поступление в дыхательные пути ЛПС сопровождалось увеличением бронхиальной и альвеолярной секреции в совокупности с уже описанным повреждением бронхиальной стенки и сосудистыми реакциями, приводящим к формированию бронхиального экссудата.

Поверхностная плотность эпителиоцитов бронхов через 3 ч с момента завершения ингаляции ЛПС практически не менялась, достоверное уменьшение величины показателя было зафиксировано через 8 ч (в 1,31 раза, P < 0,05) и 24 ч (в 1,33 раза, P < 0,05) после ингаляции. При этом если на более ранних сроках эксперимента снижение поверхностной плотности клеток бронхиального эпителия в большей мере объяснялось их набуханием и появлением складчатости эпителиального слоя, то к 24 ч с момента ингаляции преобладали истинное устранение клеток из эпителиального слоя и его дезинтеграция.

Проникновение ЛПС в ткани легких сопровождалось увеличением численной плотности бронхиальных МФ начиная с 8 ч от завершения ингаляции: в 1,63 раза на этом сроке (P < 0,01), в 1,69 раза – к 24 ч (P < 0,01). Основной причиной данного изменения стало появление новых скоплений МФ в стенке бронхов и увеличение численности уже имеющихся групп МФ, что может быть объяснено, с учетом динамики эксперимента, исключительно миграцией моноцитов из кровотока.

Воздействие ЛПС сопровождалось значительным снижением воздушности легочной ткани. К 3 ч объемная доля воздуха альвеол уменьшалась в 1,3 раза (P < 0,05), к 8 ч – в 1,7 раза (P < 0,05), к 24 ч – почти вдвое (P<0,01). Выявленные изменения стали следствием сосудистых нарушений, нарастающего тканевого отека, а к 24 ч с момента ингаляции – клеточной экссудации в межальвеолярные перегородки.

В альвеолах поверхностная плотность клеток эпителия прогрессивно уменьшалось во время эксперимента, так что величина показателя была ниже значения в контрольной группе к 3 ч после ингаляции ЛПС в 1,24 раза

(P < 0,05), к 8 ч – в 1,40 раза (P < 0,05), к 24 ч – в 1,61 раза (P < 0,01). Эта динамика явилась отражением повреждения альвеолярного эпителия, которое не прекращалось достаточно длительное время уже в отсутствие высокого содержания ЛПС во вдыхаемом воздухе, тканях легких и системном кровотоке.

Уже с первых часов эксперимента в межальвеолярных перегородках наблюдались скопления МФ с гиперэкспрессией CD-68, которые располагались группами по 2–5 клеток. В последующем существенных изменений в их численности и характере тканевого распределения, по сравнению с более ранними сроками опыта, не происходило. Численная плотность альвеолярных МФ возрастала через 3 ч с момента завершения ингаляции ЛПС в 2,25 раза, к 8 ч – в 2,53 раза, к 24 ч – в 2,74 раза (все P < 0,001). Основной причиной данных изменений было активное проникновение моноцитов из кровотока, что подтверждалось обнаружением маргинации этих клеток в просветах расширенных капилляров межальвеолярных перегородок.

Как известно, активированные МФ выделяют комплекс биологически активных веществ (фактор некроза опухоли α , интерлейкины, интерфероны), которые опосредуют большинство цитотоксических и провоспали-тельных реакций тканей в ответ на поступление в них ЛПС. Активация МФ, а также массивная миграция гранулоцитов и особенно лимфоцитов из кровотока усугубляют картину сосудистых нарушений и вызывают дополнительное повреждение эпителия и эндотелиальных клеток [3; 9].

Альфа-антитрипсин в тканях легких животных контрольной группы и к 3 ч после ингаляции ЛПС визуализировался по поверхности бронхиальной выстилки и в бронхоальвеолярной жидкости, в том числе в альвеолярном экссудате. Высокая экспрессия антитрипсина выявлялась в клетках, где он синтезируется: эпителиоцитах 2-го типа и бронхиальном эпителии. На более поздних сроках эксперимента легочная ткань почти полностью утрачивала альфа-антитрипсин, за исключением участков эпителия бронхов в прикорневых областях легких, где выявлялись небольшие количества этой антипротеазы. Выявленное уменьшение активности альфа-антитрипсина, регулирующего в легких время циркуляции цитокинов, пептидных гормонов, а также активность ферментов тканевого разрушения при острой патологии (катепсинов, фосфолипаз) и сигнальных киназ, мы рассматриваем как один из негативных моментов острого ингаляционного отравления. Инактивация альфа-антитрипсина, характерная для поздних сроков острого ингаляционного отравления, может рассматриваться в качестве еще одного признака необратимости последствий острого токсического повреждения легких данной интенсивности.

Десминпозитивные клетки в легких крыс контрольной группы выявлялись исключительно в составе мышечных слоев бронхов и сосудов малого круга. Начиная с самых ранних сроков эксперимента в опытной группе они обнаруживались не только в разрыхленных и местами поврежденных мышечных слоях артерий и бронхов, но и вокруг них. В межальвеолярных перегородках такие клетки образовывали группы по 5–6, окруженные макрофагами. Именно такие скопления были нами рассмотрены как потенциальные очаги формирования заместительного пневмофиброза при остром токсическом повреждении.

С учетом изложенных фактов и данных научной литературы об отдельных межклеточных взаимодействиях в легких [6; 11; 15], общие черты ингаляционного повреждения легких ЛПС в нашей модели можно представить следующим образом (см. рисунок).

Токсический агент в виде ультрадиспер-сного аэрозоля проникает непосредственно в просвет альвеол. Частичная его задержка в слое сурфактанта сопровождается удалением части ЛПС в бронхоальвеолярную жидкость, связыванием и инактивацией клеток и веществ в составе этой жидкости. Поступивший в ткани ЛПС практически не взаимодействует с аль-веоцитами, но оказывает мощное воздействие на МФ (рецепторы CD14 и TLR4) и эндотелий сосудов (CD14). Именно эти клетки становятся источником нарастающей лавины медиаторов острого токсического повреждения: фактора некроза опухоли альфа, интерлейкинов, простаноидов и оксида азота. Молекулы ЛПС, не нашедшие рецепторы на мембране клеток-мишеней, быстро связываются со специфическими белками, иммуноглобулинами, удаляются в кровоток или разрушаются на месте тканевыми ферментами. Медиаторы опосредуют повреждение альвеоцитов I типа, активацию синтеза сурфактанта альвеоцита-ми II типа, по принципу положительной обратной связи воздействуют на МФ и эндотелиальные клетки. Сосудистые реакции и повреждение клеток альвеолярной выстилки приводят в итоге к нарушениям эластичности межальвеолярных перегородок, ателектазам и нарушениям легочного газообмена.

Взаимодействие липополисахарида с рецепторами клеток-мишеней в межальвеолярной перегородке и выброс медиаторов в модели острого легочного повреждения

Заключение

Полученные данные свидетельствуют о том, что однократная ингаляция ультрадиспер-сного аэрозоля бактериального ЛПС сопровождается в эксперименте развитием типичного острого токсического повреждения легких, которое по своим характеристикам подходит в качестве адекватной модели соответствующей нозологии у человека. Количественное морфологическое исследование является достаточно информативным методом для оценки состояния легочной ткани при таком варианте повреждения, а его дополнение методами иммуногистохимии позволяет дополнительно отслеживать в динамике отдельные механизмы легочного повреждения и компенсаторные процессы в ответ на него. Наиболее яркими проявлениями этого повреждения в респираторных отделах легких являются сосудистые реакции, реакции альвеолярных макрофагов, в несколько меньшей степени – повреждение собственно альвеолярного эпителия. Острое легочное повреждение в данной модели сопровождается ранней миграцией миофибробластов в межальвеолярные перегородки, а также инактивацией альфа-антитрипсина в легочной ткани. Представленная модель может быть рекомендована для изучения патогенеза и возможных путей фармакологической коррекции повреждения легочной ткани, вызванной аэрозольным проникновением бактериальных токсинов.