Модельные хлорофилл- и хинон-содержащие системы, восстанавливающие кислород и теллурит

В. Г. Ременников, М. В. Гирёва, И. О. Белевич

Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15

Установлено, что модельные системы, содержащие хлорофилл а в водном растворе детергента и аскорбата, при освещении способны восстанавливать оксианионы теллурита, что сопровождается почернением среды. Восстановление теллурита, вероятно, происходит по механизму фотооксидазной реакции. Теллурит восстанавливается и в хинон-содержащих модельных системах.

Изолированные пигменты - хлорофилл, бактериохлорофилл - и их безмагниевые производные, инкубируемые в водном растворе детергентов, способны к фотоокислению кислородом (Шапошникова, Красновский, Дроздова, 1971; Шапошникова, Красновский, 1973), которое сопровождается поглощением его из среды инкубации. Проведение исследований на модельных пигментных системах правомерно, так как первичные процессы, проходящие с пигментом в результате взаимодействия его со светом, и первичные фотохимические изменения в клетке вряд ли существенно отличаются in vivo и in vitro (Евстигнеев, 1975).

Цель настоящей работы - оценка возможности восстановления теллурита с использованием хлорофилла а и хинона в модельных экспериментах.

Объекты и методы исследования

В работе использовали химически чистый хлорофилл а фирмы Fluka AG, Buchs и серные пурпурные бактерии Ectothiorhodospira halophila 51/1в 9624, полученые из коллекции кафедры микробиологии Московского госуниверситета.

Степень фотоиндуцированного поглощения кислорода хлорофиллом а и клетками Е. halophila изучали полярографическим методом с использованием электрода Кларка в герметичной ячейке объемом 1.5 мл в условиях непрерывного перемешивания. Содержание хлорофилла а в водном растворе детергента Тритона Х-100 (0.3%) составляло 0.4 мкМ. Время преинкубации хлорофилла в растворе детергента - 5 мин. Клетки Е. halophila, выращенные в анаэробных условиях до стационарной фазы, вносили в измерительную ячейку в объеме 500 мкл (конечная плотность ОГ17₅о=2.7), содержащую 50 мМ трис-HCl- буфер (pH 7.6), 10 мМ трис -аскорбат, 20 % NaCl.

Хинон-содержащая система представляла собой водный раствор хинона (витамин К3) в концентрации 10"4 М. Определение степени поглощения кислорода, обусловленное окислением ионов железа и 1,4-нафтохинона, проводили в среде, содержащей 50 мМ трис-НС1-буфер (pH 7.6), 10 мМ ас-корбат-трис, с присутствием 50 мкМ FeSO4, 1 мкМ и 10 мкМ 1,4-нафтохинон.

Результаты и обсуждение

В водном растворе Тритона Х-100 на свету в присутствии хлорофилла а и аскорбата наблюдается поглощение кислорода. Как видно из рис.1, поглощение кислорода прекращается при выключении

Время, мин

Рис. 1. Фотоиндуцированное поглощение кислорода хлорофиллом а в водном растворе Тритона Х-100 и аскорбиновой кислоты.

Среда инкубации: 50 мМ трис-НС1-буфер (pH 7.6), 10 мМ трис-аскорбат. Добавки: 1 0 мМ NaN3, 100 мМ трис-аскорбат , Вкл и Вык -включение и выключение света

света и добавлении азида, но возобновляется после включения света. При этом ингибирующее действие азида снимается внесением высоких концентраций аскорбиновой кислоты.

Скорость фотоиндуцированного поглощения кислорода зависит от количественного содержания пигмента и линейно возрастает при увеличении его концентрации от 0.005 до 2.0 мкг/мл, что свидетельствует о возможности использования полярографического метода для определения хлорофилла а в растворе в низких концентрациях. При достижении максимальной скорости поглощения кислорода на фоне увеличения концентрации хлорофилла более чем 2.0 мкг/мл линейность данного процесса нарушается (рис. 2).

Рис. 2. Зависимость скорости фотоиндуцированного поглощения кислорода от концентрации хлорофилла а

Сравнивая влияние азида натрия на поглощение кислорода клетками Е. halophila и хлорофиллом а отмечаем, что поведение данных объектов сходно. Как видно из рис. 3, уровень ингибирования фотооксидазной реакции, как хлорофиллом а, так

Рис. 3. Зависимость скорости фотоиндуцированного поглощения кислорода клетками Е. halophila и хлорофиллом а, встроенным в мицеллы детергента Тритона

Х-100, от концентрации азида и интактными клетками Е. halophila, зависит от концентрации в среде азида и существенно повышается с увеличением последнего. Схожесть кинетики процессов указывает на идентичность их природы.

Скорость фотооксидазной реакции модельных пигментсодержащих систем и бактериальных клеток не зависит от значения pH среды инкубации (рис. 4), что согласуется с данными опытов, проведенных на изолированных из клеток комплексах реакционных центров, пигмент-белковых комплексах светособирающей антенны (Ременников, Самуилов, 1980) и хлорофилле a (Abdourashitova et al., 1984).

О2, мкМ

и хлорофилл а и клетки Е. halophila

Рис. 4. Влияние pH среды инкубации на фотооксидазную активность клеток Е. halophila и бактериохлорофилла а. Данные выражены в мкМ О₂, поглощенного за 1 мин.

Таким образом, можно полагать, что фотооксидазная активность пурпурных бактерий Е. halophila обусловлена непосредственным взаимодействием бактериохлорофилла антенны с кислородом. Возможно, что этот процесс выполняет приспособительную функцию, биологический смысл которой заключается в удалении кислорода из среды инкубации и обеспечении анаэробных условий, необходимых для развития бактериальной популяции.

По нашим данным, фотооксидазная реакция способна восстанавливать не только кислород, но и оксианионы теллурита (рис. 5).

Рис. 5. Фотовосстановление теллурита калия хлорофиллом а (1, 2, 3) и хиноном (4, 5)

В первой пробирке - результат восстановления теллурита хлорофиллом а, встроенным в мицеллы детергента Тритона Х-100; в качестве донора электронов использована аскорбиновая кислота в концентрации 10 мМ. В данном случае происходит восстановление теллурита до теллура (Мооге, Kaplan, 1992), что выражается в почернении содержимого пробирки.

Во второй пробирке в теллурит добавлен азид натрия (NaN₃) 10 мМ. Азид ингибирует процесс восстановления теллурита подобно подавлению фотооксидазной реакции (Барский и др., 1986; Ре-менников, 1996). В результате добавления 100 мМ аскорбиновой кислоты происходит снятие ингибирующего действия азида и наблюдается восстановление теллурита до элементарного теллура, о чем свидетельствует черное окрашивание (пробирка 3). Азид, ингибирующий фотоокисление хлорофилла а, является конкурентом аскорбата и кислорода (Барский и др., 1986) (и, вероятно, теллурита). Следовательно, азид конкурентно подавляет процесс взаимодействия аскорбата и окисленной молекулы хлорофилла. Наряду с этим азид является окислителем, так как конкурирует с кислородом -акцептором электронов, поступающих от возбужденного хлорофилла.

Аналогичный результат получен нами в опыте с использованием хинонов (пробирки 4, 5). Хиноны -компоненты энергопреобразующих биомембран, способные к обратимым одно- и двухэлектронным реакциям окисления-восстановления (Олескин, Самуилов, 1988, Нокс и др., 2004). Так, водный раствор хинона в присутствии ЮмМ аскорбиновой кислоты восстанавливает теллурит калия до теллура. Данный процесс подавляется о-фенантролином -ингибитором фотоиндуцированного поглощения кислорода (пробирка 5).

ч Установлено, что присутствие о-фенантролина подавляет процесс темнового поглощения О2, который обусловлен окислением ионов железа и 1,4-нафтохинона, восстановленных аскорбатом (рис. 6).

"4* FeSO₄ и 1,4-нафтохинон

1,4-нафтохинон

Рис. 6. Влияние о-фенантролина на поглощение кислорода.

100% соответствует 0,1 мкМ О2, поглощенного за 1 мин.

По нашим данным, степень ингибирования возрастает с увеличением концентрации о-фенантролина. Однако концентрации, подавляющие поглощение кислорода, существенно зависят от условий среды инкубации. В среде, содержащей ионы железа, действие ингибитора проявляется при его концентрации более 5.0 мкМ. Ингибирующая концентрация о-фенантролина в среде с 1,4-нафтохиноном, восстановленным аскорбатом, составляет 0.5 мМ. В условиях смешивания компонентов двух сред наблюдается двухфазность подавления поглощения О2 о-фенатролином. Первая фаза обусловлена ингибированием процесса окисления ионов железа, а вторая - окислением 1,4-нафтохинона. Хорошо выраженное плато отражает различие в чувствительности этих двух компонентов к данному ингибитору.

На этом основании можно сделать вывод о том, что о-фенантролин оказывает ингибирующее действие на систему фотоиндуцированного переноса электронов и систему дыхания. Ингибирование обусловлено взаимодействием о-фенантролина с молекулами мембранного фонда хинонов (в реакционном центре атом железа не меняет своей валентности, а в системе дыхания негемовое железо не функционирует), следствием чего является изменение их окислительно-восстановительных свойств. Ингибирование процесса окисления хинонов мембранного фонда также должно привести к накоплению восстановленной формы QB и QA.

Таким образом, эксперименты, проведенные с использованием хлорофилла а и хинона в модельных условиях, подтверждают вывод о том, что восстановление теллурита калия протекает при участии фотооксидазной реакции. Данный механизм обусловлен переносом электронов с аскорбата и непосредственным взаимодействием бактериохлорофилла а антенны с ТеО₃²" по следующей схеме: аскорбат -> бактериохлорофилл а -> ТеО₃²" —»Те°. Данный процесс можно считать экологически важным, поскольку при этом идет восстановление и детоксикация теллурита до менее токсичного теллура.