Модификация функциональных свойств белковых концентратов из белого и коричневого риса

Рис – важнейшая зерновая культура. Его употребляют в виде вареной крупы, муки, ее перерабатывают на спирт, пиво, используют при выпечке хлеба, для приготовления кондитерских, рыбных, молочных, мясных изделий [1–7].

Рисовая мука заменяет нативные, модифицированные крахмалы, концентраты и изоляты соевых белков. Рисовые продукты полезны для людей всех возрастов, особенно детей, так как являются источником незаменимых аминокислот, легко усвояемых минеральных веществ (натрий, калий,

магний, фосфор, цинк), витаминов группы В, лизина, содержание которого в зерне и отрубях может достигать 3,0–4,4% [8–10]. В продуктах из зерна риса обнаружена антиоксидантная активность, связанная с веществами фенольной природы [11–13]. Красновато-коричневый пигмент зерновок представляет смесь катехол-танинов, катехинов и флавофанов, которые могут оказывать влияние на процессы выделения и функциональные свойства белковых препаратов. У продуктов, полученных из коричневого риса, обнаружено антидиабетическое свойство, которое обеспечивается присутствием соединений для предотвращения осложнений при диабете типа 2 [14]. Белки риса не содержат белковые компоненты, которые даже у некоторых здоровых людей вызывают целиакию (нарушение пищеварения), поэтому их применяют в диетической безглю-теновой диете [15, 16]. В рационе больных целиакией не должны присутствовать продукты из пшеницы, ржи, овса, ячменя, тогда как продукты из риса могут входить в меню данной группы людей [17,18], потому что в его составе большая часть приходится на белки глютелиновой фракции [19]. Для получения белковых продуктов часто используют растворы щелочи, которые могут денатурировать нативные белки и разрушать структуру аминокислот, чаще – лизина [20–22]. В результате могут ухудшаться свойства белковых продуктов, поэтому разрабатывают способы выделения продуктов в комплексе с ферментными препаратами (9; 23–26).

Нами разработаны способы получения двух видов белковых концентратов (БК) из рисовой муки, смолотой из белого и коричневого риса, предназначенных для больных целиакией, но без растворов щелочи. Для этого рисовую муку обрабатывали ферментными препаратами (ФП) амилазного и ксиланазного действия c последующим воздействием на сырье разбавленной соляной кислотой [27]. Для получения БК белки из раствора осаждали в изоэлектрической точке (рН 7,2 ± 0,2). При получении белково-кальци-евых концентратов (БКК) их также осаждали в изоэлектрической точке, но с использованием трехзамещенного цитрата кальция. БК и БКК, полученные из белого и коричневого риса, отличались между собой по массовой доле белка, крахмала, минеральных веществ (кальций, калий, магний, железо и др.). Различия в химическом составе и пищевой ценности БК и БКК могли отразиться и на их функциональных свойствах, значения которых важны для использования БК в производстве различных видов пищевых продуктов. Следовательно, актуальным было исследование функциональных свойств БК и БКК, полученных по нашим способам, в которых не использовались растворы щелочи.

Функциональные свойства БК определяются физико-химическими и структурными особенностями их белков [28–31]. К наиболее важным функциональным свойствам белков относятся растворимость, водосвязывающая, жиросвязывающая способность, способность стабилизировать дисперсные системы (эмульсии, пены, суспензии) [32]. Для улучшения качества пищевых изделий проводят модификацию функциональных свойств БК физико-химическими, химическими, энзиматическими методами. Наиболее безопасную модификацию осуществляют с протеазами различного происхождения, при этом эффективность процесса зависит от температуры, рН, времени обработки, концентрации [33]. Для вновь полученных объектов всегда проводят исследования.

Цель работы – разработка параметров ограниченного протеолиза БК с ферментными препаратами и сравнительная характеристика функциональных свойств нативных и модифицированных белковых и белково-кальциевых концентратов, полученных из белого и коричневого риса методом протеолиза.

Материалы и методы

Использовали муку из белого риса марки “Гао там” и коричневого риса “Тхай Зыонг” (Вьетнам). Муку получали измельчением зерна, частицы которого проходили через сито № 43 ПА-70. Для гидролиза белков использовали ФП фирмы «Novozymes» (Дания) эндопротеазного действия (Protamex® и Neutrase 1,5 MG) и комплексного эндопротеазного и экзопептидазного действия (Flavourzyme 500 MG) с протеолитической активностью 125, 105 и 85 ед./г соответственно. Активность ФП определяли модифицированным методом Ансона. Все реагенты были химически чистые.

Белковые и белково-кальциевые концентраты из муки, смолотой из белого и коричневого риса, получали по способам, разработанным и описанным нами ранее в работе [27]. Для получения белковых гидролизованных концентратов (БГК) из обоих видов риса навеску БК смешивали с раствором ФП в дистиллированной воде, взятой в количестве, зависящем от величины гидромодуля. Образец выдерживали 30–210 мин при температуре 30–70 °С, после чего образцы сразу же высушивали лиофильно на установке Continuous Freeze Drye (US) до влажности 4–9%.

Химический состав. Массовую долю белка в продуктах определяли по методу Кьельдаля на приборе Kjeltek фирмы «Тесаtоr» (Швеция), влаги, золы, жира и сырой клетчатки (метод Кюшнера и Ганака) – по методам, изложенным в руководстве (Nechaev et al., 2006). Массовую долю углеводов рассчитывали путем вычета из 100 г массовой доли белка, жира, золы и влаги, г. Аминный азот в гидролизатах белков определяли методом формольного титрования, принцип которого основан на блокировании свободных аминогрупп формальдегидом (рН 7,0) и титровании раствором щелочи карбоксильных групп. Начало и конец титрования определяли потенциометрически. В пробирку отбирали 4,5±0,0001 г гидролизата, добавляли 65 см³ дистиллированной воды и диспергировали в гомогенизаторе 4–5 мин. Раствор центрифугировали при 6000 g 20 мин, надсадочную жидкость сливали. Из нее отбирали пробу 5 см³ и переносили в колбу с 20 см³ воды. Нейтрализацию раствора проводили 0,1 моль/дм³ NаОН. Раствор щелочи добавляли по каплям при постоянном перемешивании, следя за показаниями потенциометра. При рН 7,0 к раствору добавляли 0,5 см³ формольной смеси с фенолфталеином и титровали 0,1 н раствором NаОН до рН 9,1–9,5, что соответствовало ярко-красному окрашиванию пробы. Степень гидролиза БК определяли по количеству аминного азота, выраженного в процентах по отношению к общему количеству аминного азота. Общее количество аминного азота определяли после полного гидролиза образца с 6 моль/дм³ НСl. Степень гидролиза белков (Dh) рассчитывали по формуле Dh = Cs / Cc· 100, где C s – содержание общего аминного азота аминокислот в образце, %; C c – содержание аминного азота в гидролизованном образце. Функциональные свойства БК, БКК, БГК определяли по методикам, описанным в работе [34]. Все результаты представлены как средние 3–5 экспериментов с применением методов дисперсного и корреляционного анализов с Q-тестом и программ Statistica 6.0 и Tablecurve 3D.

Результаты и обсуждение

Из таблицы 1, в которой представлен химический состав БК, видно, что все они содержали более 70% белка, поэтому отнесены к группе «концентраты». БК из коричневого риса содержали на 5–6% меньше белка, но больше крахмала, чем БК, выделенные из белого риса, тогда как содержание зольных элементов, клетчатки и жира почти одинаковое. Возможно, что в БК из коричневого риса белки прочно взаимодействовали с красящими веществами и влияли на их массовую долю в препаратах.

Таблица 1.

Химический состав концентратов

Table 1.

Chemical composition of protein concentrates

Компоненты Components	Белый рис White rice		Коричневый рис Brown rice
	БК 1 БКК		БК 1 БКК
	Массовая доля, г/100 г продукта Mass fraction, g/100 g of product
Влага Moisture	5,00 ± 1,11	5,00 ± 1,01	5,10 ± 0,09	5,01 ± 0,08
Белок Protein	84,1 ± 1,12	84,10 ± 1,20	79,00 ± 0,07	79,00 ± 0,60
Крахмал Starch	10,2 ± 1,20	9,60 ± 1,02	15,10 ± 1,20	14,00 ± 1,61
Клетчатка Cellulose	0,30 ± 0,05	0,36 ± 0,03	0,30 ± 0,08	0,30 ± 0,09
Жир | Fat	0,32 ± 0,06	0,33 ± 0,04	0,33 ± 0,07	0,36 ± 0,08
Зола | Ash	0,31 ± 0,03	1,30 ± 0,07	0,25 ± 0,04	1,25 ± 0,16

Разработка параметров ферментативного протеолиза БК

Влияние технологических факторов на процесс протеолиза сначала исследовали для БК, полученного из белого риса с ФП Pro-tamex®. Влияние массовой доли субстрата и продолжительности гидролиза на содержание аминного азота изучали при концентрации БК от 20 ÷ 35% в дистиллированной воде при рН 6,2 Показано, что наибольшее количество азота выделялось при 25% БК (рисунок 1), 50 °С и 150–180 мин гидролиза (рисунок 2). Наиболее эффективным значением рН для действия фермента являлось 5,0–6,0 при продолжительности гидролиза 120–180 мин (рисунок 3). Наибольшее количество аминного азота выделялось при концентрации ФП 1,0–1,4 Е/г (рисунок 4). Таким образом, для ФП Protamex® и БК параметры гидролиза: температура 50 °С, концентрация субстрата 25%, концентрация ФП 1,0–1,4 Е/г, рН = 5,0–6,0, продолжительность 150–180 мин. Максимальное количество аминого азота (900–920 мг%) выделялось при степени протеолиза 3,89–4,03%.

Hydrolysis time, min

Hydrolysis time, min

Рисунок 4. Влияние концентрации ФП на содержание аминного азота, Е/г белка: 1 – 0,6; 2 – 1,0; 3 – 1,4

Рисунок 1. Влияние продолжительности гидролиза и массовой доли субстрата (%) на содержание аминного азота, %: 1 – 20; 2 – 25; 3 – 30; 4 – 35

Figure 1. Effect of the duration of hydrolysis (minutes) and the mass fraction of the substrate (%) on the content of amine nitrogen, %: 1 – 20; 2 – 25; 3 – 30; 4 – 35

Hydrolysis time, min

Рисунок 2. Влияние продолжительности гидролиза и температуры на содержание аминного азота, °С: 1–40; 2–50; 3–60

Figure 2. Influence of temperature and duration of hydrolysis on the content of amine nitrogen, °С: 1–40; 2–50; 3–60

Hydrolysis time, min

Рисунок 3. Влияние рН и продолжительности гидролиза на содержание аминного азота, рН: 1 – 4,0;

2 – 5,0; 3 – 6,0; 4 – 7,0

• Figure 3.    Effect of рН and duration of hydrolysis on the content of amine nitrogen, рН: 1 – 4.0; 2 – 5.0; 3 – 6.0; 4 – 7.0

• Figure 4.    Effect of the concentration of Protamex® on the content of amine nitrogen, E / g protein: 1 – 0.6;

2 – 1.0; 3 – 1.4

Параметры гидролиза рисового БК с ФП Protamex® использованы для протеолиза с эндопротеиназным ФП Neutrase 1.5 MG при концентрации 0,6, 1,0 и 1,4 Е/г и продолжительности 180 мин. Показано, что количество аминного азота, выделившегося с ФП Protamex®, больше на 11–23%, чем количество с ФП Neutrase 1,5 MG. Следовательно, Protamex® является более эффективным препаратом для протеолиза рисовых БК, чем Neutrase 1,5 MG, как и для пшеничной клейковины [35].

Параметры протеолиза с ФП Protamex® использовали и для определения оптимальных режимов гидролиза рисовых БК с ФП Flavourzyme 500 MG, содержащим эндопроте-азную и экзопептидазную активность. Для получения результатов по влиянию различных факторов на содержание аминного азота использовали методы математического планирования эксперимента. Массовая доля субстрата 25%, рН = 6,0 – 6,2 (const). Время гидролиза (Х 3 ) изменяли в интервале 60÷240 мин, температуру (Х 1 ) – в диапазоне 40–60 °С, концентрацию ФП (Х 2 ) – от 0,3 до 1,5 Е/г белка. По данным эксперимента с помощью программы TableCurve 3D построены поверхности отклика для аминного азота (рисунок 5). Обработка данных в программах Matematika и Table Сurvе позволила получить оптимальные параметры гидролиза БК для точек экстремума максимума аминного азота: температура 55 °С, концентрация ФП – 1,5 Е/г белка, время гидролиза – 195 мин. Степень протеолиза при этом составила не более 4,16%:

ЛЬсйя

У ре®11

Рисунок 5. Зависимость количества аминного азота от параметров гидролиза

• Figure 5.    Dependence of the amount of amine nitrogen on hydrolysis parameters

  Y = -5341,16 + 134,2741Х 1 – 18,9436Х 2 + 2,549306Х 3 -1,38757Х 1 ^{2 –} 103,741Х 2 ² – – 0,0729Х 3 ² +10,54811Х 1 Х 2 +0,005208Х 2 Х 3 +0,0143Х 1 Х 3 .

Функциональный свойства БК и влияние на них различных факторов

Для оценки возможности использования БК в производстве различных пищевых изделий изучены их функциональные свойства. Нами исследовано по три вида концентратов из белого и коричневого риса: БК, БКК и БГК. ЖСС, ВСС и растворимость БК из белого риса выше на 10–15%, чем аналогичные свойства БК из коричневого риса. Значительные различия обнаружены и для свойств пены: ПОС почти в 5–6 раз выше у БК из белого риса, чем из коричневого риса; стабильность пены у последнего вообще отсутствовала.

Осаждение белков солями кальция практически не влияло на растворимость, ЖСС и ЖЭС. Значения функциональных свойств у БК из белого риса по-прежнему оставались несколько выше, чем у БК из коричневого риса. По ВСС, ЖСС, ЖЭС и растворимости белки белого риса, полученные с осаждением цитратом кальция и без него, практически не отличались друг от друга, тогда как ПОС у обоих БКК была ниже: из белого риса – на 11%, из коричневого – на 52%. Стабильность пены концентратов, выделенных из белого риса, понизилась на 18%, а у БК из коричневого риса она вновь отсутствовала. Следовательно, пенообразующие свойства концентратов изменялись под влиянием соли цитрата кальция, используемого при осаждении белков.

Функциональные свойства БГК из белого и коричневого риса, полученных с ФП Рrоtаmех®, отличались от свойств негидролизованных БК. Так, ВСС у БГК белого риса на 19% выше, а ПОС – в 3 раза больше, тогда как ЖСС, ЖЭС и СЭ, наоборот, несколько меньше (до 8%), чем у негидролизованных БК. Аналогичная закономерность установлена и для БГК из коричневого риса: ВСС выше на 14%, ПОС – в 3,5 раза, а ЖСС, ЖЭС и СЭ у БГК, наоборот, на 7–15% ниже. Растворимость белков обоих БГК повышалась в 11–14 раз. Важно отметить, что БГК из белого риса обладал всегда более высокими функциональными свойствами, чем БГК из коричневого риса: ВСС, ЖСС, ЖЭС и СЭ выше на 7–18%, ПОС – в 5 раз, растворимость больше на 21%. Пена у БГК, как и у БК и БКК из коричневого риса, также не обладала стабильностью.

Функциональные свойства белковых продуктов зависят от условий их применения, поэтому изучали влияние рН на их функциональные свойства на модельных растворах, варьируя значения рН в 0,01 М К, Na-буферных растворах. Растворимость белков, выраженная в % от общего количества их в навеске, при всех значениях рН, кроме изоэлектрической точки (около 7), в сильнокислых и сильнощелочных средах была выше у БК из белого риса, чем из коричневого (рисунок 6).

Рисунок 6. Растворимость БК при разных значениях рН: БК из белого риса: 1 – БК; 2 – ГБК; БК из коричневого риса: 3 – БК; 4 – ГБК

• Figure 6.    The solubility of PC at different рН values: PC of white rice: 1 – PC; 2 – HPC; PC from brown rice: 3 –

PC; 4 – HPC

При рН 5÷9 растворимость белков в 2,0–2,7 раза выше у БГК, чем у негидролизованных БК. Даже в изоэлектрической точке она более высокая (34–40%), поэтому данные продукты перспективны для изготовления коктейлей, напитков, мучных кондитерских изделий, приготовленных с разрыхлителями (рН 7,5–9,5). Выявленные различия в растворимости концентратов, полученных из двух видов риса, в целом сохранялись и в диапазоне значений рН от 4 до 8 для ВСС, ЖСС, ПОС и ЖЭС (рисунок 7). Однако прослеживалась и другая закономерность: в слабокислых средах при рН 4–6 значения ВСС, ЖСС, ЖЭС и ПОС ниже, чем в нейтральной и слабощелочной среде. Наиболее высокие показатели наблюдались при нейтральном и слабощелочном значении рН (8,0). При данных условиях в большей степени изменялись ЖЭС, ВСС и ЖСС, в меньшей степени – ПОС.

-*- 1

-•- 3

-■— 4

рН

Рисунок 7. Влияние рН среды на функциональные свойства БК: концентраты из белого риса: 1 – БК; 2 – БГК; концентраты из коричневого риса: 3 – БК; 4 – БГК

Figure 7. The effect of рН on the functional properties of PC: concentrates of white rice: 1 – PC; 2 – HPC; brown rice concentrates: 3 – PC; 4 – HPC

Заключение

Разработаны процессы протеолиза БК и БКК, полученных из белого и коричневого риса. Определены оптимальные условия для гидролиза БК с ФП эндопротезного действия (Protamex® , Neutrase 1.5МG) и комбинированного эндопротезного и экзопептидазного действия (Flavourzyme 500 MG) для достижения степени протеолиза 3,89–4,16%: концентрация субстрата 25%, концентрация ФП – 1,0–1,5 Е/г белка, температура 50–55 °С, рН = 5,0–6,2, время гидролиза 150–195 мин.

Функциональные свойства выше у БК из белого риса, чем у БК из коричневого риса: ПОС почти в 5–6 раз выше, а стабильность пены у белков из коричневого риса вообще отсутствовала. Под влиянием цитрата кальция, используемого для осаждения белков, функциональные свойства БК незначительно, но ухудшались. Функциональные свойства модифицированных БК из обоих видов риса после ферментативного гидролиза изменялись неоднозначно: ВСС, ПОС и растворимость повышались, а ЖСС, ЖЭС и СЭ, наоборот, понижались по сравнению с негидролизованными БК. Пенообразующая способность БГК из белого риса достигала ПОС яичного альбумина (300%). Следовательно, с помощью процесса ограниченного протеолиза БК, полученных из белого и коричневого риса, можно обеспечивать заданные значения функциональных свойств для применения в конкретных изделиях и пищевых системах.