Модификация MALDI-мишени наночастицами при электрораспылении суспензии оксида железа(III) в нормальных условиях

Анализ биологических образцов требует чувствительного метода обнаружения и тщательной подготовки образца к анализу, т. к. образец представляет собой сложную матрицу, а аналит, как правило, присутствует в низких концентрациях. Одним из специфичных и селективных методов, применяемых для пробоподготовки биологических образцов, является металл-аффинная хроматография. Сорбенты, применяемые в этом методе, содержат в своем составе различные металлы. Как известно, ионы переходных металлов могут взаимодействовать с различными функциональными группами органических и биоорганических молекул с разной эффективностью [1].

Как правило, металл-аффинную хроматографию проводят в микроколонках различных форматов, заполненных сорбентом, затем разделенные фракции анализируют инструментальными методами. Например, используют высокоэффективную жидкостную хроматографию или же методы масс-спектрометрии. Для биологических образцов и объектов окружающей среды актуальны методы масс-спектрометрии с мягкой ионизацией, такие как электроспрей [2, 3] и МАLDI [4].

В последнее время ученые предложили проводить пробоподготовку некоторых образцов непосредственно на поверхности стальной мишени для

МАLDI-масс-спектрометрии и в первую очередь аффинное концентрирование аналитов для целей фосфопротеомики и аддуктомики. Для этого поверхность мишени модифицируют различными методами, получая активную поверхность, которую в дальнейшем используют для разделения и концентрирования образца. Способы модификации поверхности весьма разнообразны, а в основу активной поверхности могут входить и металл-аффинные сорбенты. Например, в работе [5] использовали реактивный метод осаждения, заключающийся в электрораспылении раствора, содержащего 70% zirconium(IV)–n-propoxide на поверхность мишени, обработанную кислородной плазмой, процесс занимал от 1.5 до 4 ч. Зачастую поверхность мишени модифицировали частицами оксидов, закрепляя их при помощи полимеров [6] или нагрева [7]. Также был предложен метод получения одноразовых мишеней из алюминиевой фольги, на которую наночастицы диоксида титана наносились с помощью трафаретной печати с последующим запеканием [8].Предложенные подходы в первую очередь созданы как альтернатива трудоемкой и дорогой пробоподготовке биообразцов, направленной на концентрирование аналита перед анализом и удаление примесей.

В нашей работе предложен метод модифицирования поверхности МАLDI-мишени металл-аффинными сорбентами в ходе электрораспыле-

Рис. 1. Ви д п я тна н а н од ис п ерсного сорбе н та н а ос н ове ок си да желе з а н а подложке пр и эле к трора с пыле н ии с сп е н з ии с д инами че с к им д еле н ием потока в б ес к ап е льном режим е . Д и ам е тр п ятна ~5 мм

Рис. 2. Схема экспери м е н тальн ой ус т ан ов к и п о н а нес е ни ю сорбента н а п од л ож к у с и сп о льзов а ни е м м е тоди к и эл е к т ро ра с п ыления в бескапельном режиме.

• 1    — у стройс тв о д ес орб ции заряжен н ых частиц; 2 — м ета л личе с ки й капи л ляр;

• 3    — шприц; 4 — блок питания; 5 — высоковольтный контакт; 6 — кап и л л я р -изолятор;

• 7    — воздушный мембранный н а с ос; 8 — входной механический м а н оме триче ский датчик; 9 — автомобильный топливный фильтр TS07T; 10 — выходной механический манометрический датчик; 11 — механический ротаметр; 12 — ручной механический клапан; 13 — автомобильный топливный фильтр TS03T; 14 — п р от и воэле кт р од; 15 — МАLDI-мишень; 16 — м икроск оп ; 17 — цифровая видеокамера; 18 — компьютер; 19 — светодиодный узел; 20 — источник питания светодиодов

ния в н ормаль н ых услов и ях, н е тре б ующий п р имен е ния вы с оки х те мпе р атур ил и поли ме ров. Для моди ф икаци и п о верхн ос ти исп о л ьзов али р анее разрабо та нный метал л -аффинный сорбент на основе оксида желез а (II I ) [9], показавший эффективнос ть для реш е ния з ада ч к л а сс и ческой фосфопротеомики.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ УСТАНОВКА

В работе использовали устройство, позволяющее проводить электрораспыление суспензии на-нодисперсного оксида железа(III) в 50% водно-метанольном растворе с добавлением трифторуксусной кислоты до концентрации 0.1%. Электрораспыление проводилось в бескапельном режиме с динамическим делением потока суспензии при нормальных условиях при атмосферном давлении. Нанодисперсные частицы сорбента наносились на поверхность подложки из нержавеющей стали для МАLDI-масс-спектрометрического анализа. Движение наночастиц осуществлялось в электрическом поле между вершиной мениска распыляемой суспензии и подложкой. Поверхность подложки предварительно обезжиривали ацетоном и дополнительно никак не подготавливали. В результате электрораспыления на поверхности подложки формировалось пятно сорбента (рис. 1). Сформированные пятна устойчивы к воздействию растворителей, используемых для металл-аффинной хроматографии.

На рис. 2 показана схема экспериментальной установки с использованием новой методики электрораспыления в бескапельном режиме. Устройство электрораспыления и методика, которые позво- ляют реализовать электрораспыление в бескапель-ном режиме при нормальных условиях, подробно описаны в [10]. Установка, на которой производилось напыление наночастиц, включает устройство десорбции заряженных частиц в бескапельном режиме при нормальных условиях (1), состоящее из металлического капилляра (2), по которому поступает коллоидный раствор в область сильного электрического поля на свободном торце капилляра. С другой стороны капилляр присоединен тефлоновой трубкой к системе подачи раствора (3). На металлический капилляр также подается управляемое высокое напряжение (до 5 кВ) от блока питания (4) Stanford research systems Model PS 380/5000V/25W через контакт (5). Вокруг металлического капилляра коаксиально расположен капилляр-изолятор (6) с внутренним диаметром, бóльшим внешнего диаметра металлического капилляра (2), при этом свободный торец металлического капилляра длиннее капилляра изолятора, что позволяет эффективно отсасывать лабораторный воздух в окрестностях мениска. Под воздействием потока воздуха излишек раствора движется по поверхности мениска в сторону, обратную вершине мениска, из которой происходит эмиссия заряженных частиц. Откачка парогазовой смеси, состоящей из лабораторного воздуха и излишков раствора, производится по коаксиальному зазору между капиллярами (2) и (6). Откачивается смесь с помощью воздушного мембранного насоса (7) DAP-6DULVAC. Перед насосом установлена система фильтрации, состоящая из последовательно соединенных входного механического манометрического датчика (8), четырех автомобильных топливных фильтров TS07T (9), выходного механического манометрического датчика (10), за которым расположен механический ротаметр (11) с ручным механическим клапаном (12) для регулировки потока парогазовой смеси и автомобильный топливный фильтр TS03T (13). Напротив металлического капилляра (2) устройства десорбции заряженных частиц (1) расположен противоэлектрод (14), представляющий собой либо пластину из нержавеющей стали, либо установленную на нее МАLDI-мишень MALDI Plate (384 circles, 700 um spot dimension) (15). Для визуального наблюдения мениска и процесса десорбции использовали микроскоп (16) МВС-10 (Россия) с расположенной на нем цифровой видеокамерой (17) Lumenera LU100M с USB-выходом. Изображение с видеокамеры поступало на компьютер (18). Для освещения непосредственно области мениска раствора и участка противоэлектрода, на который производилось напыление, использовался светодиодный узел (19), а в качестве источника питания светодиодного узла — блок (20) Agilent E36612 A.

Для бескапельной п ол ев ой д есорб ц и и з а р я ж е нных ча сти ц с в ерш и ны менис к а не о бходимы м усло в и е м я в ляетс я с та биль н ый п оток су с пе н зи и , под б ор опти ма л ьн ого напряжения н а э л е к трода х и стаби ль ный п оток отк а чивае мой и з об ла сти м ениска парогазов ой с меси, с о ст оя щей из ла б ораторного воздуха, растворителя, и сп о льзуе мо го в суспензии, и частиц с о рбента. Д л я кон трол я режима бескапельного эл е ктрорас п ыл е н и я и его стабил ьн ости осу щ ествл я етс я н а блюд е н и е за ф ормой мен и ск а на торце ме та лл и че с кого капилляра. Бес-капельному рас п ыл е нию соответс тв уе т ме н иск харак те рной формы , изо б раж е н и е которого представлено на рис. 3 . В а жны м ус л овие м явл яе тс я отсутс тв и е в иди мой струи ми к рокап е ль и з в е ршины мениска.

Рис. 3. Фотогра фи я фо рм ы м е н ис к а в р еж и ме бес к ап е л ь ного эле к тр ора с п ылен и я

Рис. 4. М ише н ь, поверхност ь которой мод и фицирова н а с ор б ен т ом н а ос н ов е ок с ид а железа при бескапельном электрораспылении

В случаях несоответс т ви я ф о рмы менис к а реж и му б еск а п е ль н ого электрораспыления нанесение нан оча с ти ц на поверхность МАLDI-мишени не ос уще с тв л яе т ся т. к . напы ле нны й вм е сте с каплями р а с тв ори теля с орб ент н е зак ре п л ялс я на пов е р хн ости под л ожки п осле в ысых а н и я жид к о с ти. Для вы х од а н а ну ж н ы й реж и м регулировали следу ющ ие п а раметры: ра с с то я н ие ме ж д у торц ом металлического к а пилл яра и миш е н ь ю, н апряж е ние меж д у элект род ами , с к оро с ть откачки п отока с меси лаб ора торного воздуха и из л ишков жи д кост и на торц е к а п и лл яра .

После в ы вода н а ре ж и м б ескап е льного электрораспы л е н ия регулирован и ем п ара ме тров на ус т анов к е реж и м оста в а лс я стабильным на время распы ле ния. Д л я п ол у че н и я одн ог о пятна н а п ов е р хн ости м иш е ни требов а л ос ь ок оло 20 ми н . Напряжен и е меж д у электрод а ми с оста в ляло 4300– 4800 В . Р ас с тояние — порядка 10 мм, объемный расход жи д кос ти на хо ди тс я в диапазоне 100– 150 мкл/ ми н. С у спензи ю пре д ва ри те ль но тщательно п еремешивал и и помещали в УЗ-ванну на 30 ми н . В х оде э лек тр о ра сп ы ле н и я в объем емкости с с успен зи ей оп ус к али ба рб отер, ч т об ы н е допу с тить возмож н ости оседания частиц на стенках емкости.

В ходе э лек трора сп ы ле н и я сус п ензии, содерж а ще й частицы с орбента, на п ове р хнос ти ста л ьной п лас ти ны (рис. 1 ) и ли М АLDI-мишени (рис. 4) ф орми руется п ятн о, образованное сорбентом. Пятн о и ме е т к ру г л ую ф орму и более на с ыщенн о в цен тре , чем по кра я м . Сформи ро ван н ы е в ходе э л ектрораспыл е ния п ятна устойчивы к стиранию и возд е й с тв и ю ра ств ори те л е й , и с пользуе мы х в ме-талл-а ф финн ой хро ма тог рафи и .

Важное свойство металлопокрытия — это прочность его сцепления с основным металлом подложки. Межатомные силы характеризуют прочность покрытия на подложке и наиболее сильно действуют на близких расстояниях, порядка нескольких ангстрем. Поэтому для прочного металлопокрытия на подложке покрываемая поверхность должна быть металлически чистой. В случае, когда параметры кристаллической решетки подложки отличаются от решетки покрытия не более 2.4–12.5%, прочность сцепления наиболее сильна [11]. Воспроизводство структуры металла подложки возможно, когда параметры решетки металла подложки и металлического покрытия мало отличаются.

С п омощью с к ан и рующ е г о электрон н ого ми кроскопа Hitachi S-3400N, в с остав которого входит аналитическая приставка Oxford Inst r ume nt s X -Max 20, были п олучены ми крофотог р афии н анес е нн ог о н а с тальну ю подлож к у с орб ента на основе оксида железа(III) ( ри с. 5) . На и зоб раж е нии видны ча с тиц ы сор б ен та , п ов ер хн ость к ото рых доступна для проведения металл-а ф фи н н ог о ан а л и за .

МАLDI-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

На модифицированных пятнах МАLD I -мишени провели металл-а ф финн ое об ог а ще н ия образца фосфорилированного пептида с а ми н окислотной п ос л е довате ль но с тью SS NGH V(pY) EKLS S I и молек у л ярн ой масс ой 1499 Да и з образц а три п ти ч еского гидролизата глобина человека.

В одн ы й рас тв ор п е пти д а SSNG HV( pY)EKLSSI (100 мк г /мл) смеш и вали с водн ым ра ство ро м триптического гидролизата г ло би н а че л о в ека (к он ц е нтра ц ия глобина д о триптиче с кого г идролиза сос та в ляла 1 мг /мл) в соотнош е нии 1: 1 0.

Рис. 5. Микрофотография пов е рхнос ти ста л ьн ой п л а с т инки, повер х н ос ть которой м од ифиц и рована с о рб е нт ом н а ос нов е оксида железа

На пятно с сорбентом нанесли 5 мкл 70% водного ацетонитрила, выдерживали 1 мин, жидкую фракцию удаляли. На пятно нанесли 8 мкл 1.5% водного раствора аммиака и 1 мкл образца и инкубировали в течение 20 мин, затем каплю собирали и переносили на свободное пятно мишени для последующего контроля проскока с сорбента. Затем провели процедуру промывки: на пятно сорбента наносили 3 мкл 1.5% водного раствора аммиака, пипетировали и удаляли с поверхности. Процедуру повторяли трижды. Далее на пятно сорбента наносили 3 мкл насыщенного раствора α-циано-4-гидроксикоричной кислоты в 50% водном ацетонитриле с 0.1% трифторуксусной кислотой (здесь и далее все Sigma Aldrich). После высушивания мишень помещали в масс-спектрометр MALDI-TOF-MS Axima Performance (Shimadzu), и регистрировали масс-спектры в режиме положительных ионов в диапазоне от 700 до 3000 Да. После ме-талл-аффинного анализа в спектре надежно детектируется и идентифицируется сигнал, соответствующий протонированной форме пептида SSNGHV(pY)EKLSSI (m/z 1500) (рис. 6). При этом при удалении супернатанта и на стадии отмывки поверхности модифицированного пятна происходит удаление примесей и нецелевых соединений, достигается эффект концентрирования и повышения чувствительности детекции.

Рис. 6. МАLDI-масс-спектры.

а — триптический гидролизат глобина человека; б — триптический гидролизат глобина человека с введенным фосфорилированным пептидом; в — триптический гидролизат глобина человека с введенным фосфорилированным пептидом после металл-аффинной хроматографии на МАLDI-мишени

ВЫВОДЫ

Разработана установка, позволяющая наносить на поверхность МАLDI-мишени металл-оксидные сорбенты методом электрораспыления в ходе полевой десорбции наночастиц на поверхность мишени. Поверхность МАLDI-мишени была модифицирована сорбентом на основе оксида железа(III). Полученное покрытие устойчиво к механическому воздействию, воздействию органических растворителей и воды. На модифицированной поверхности мишени проведено металл-аффинное обогащение образца фосфорилированного пептида из триптического гидролизата глобина человека. Для проведения пробоподготовки предложенным методом требуемые объемы образца и растворителей составляют порядка 10 мкл, а десорбция образца с сорбента проходит на стадии нанесения матрицы для МАLDI. При удалении супернатанта и на стадии отмывки поверхности модифицированного пятна происходит удаление примесей и нецелевых соединений, достигается эффект концентрирования и повышения чувствительности детекции.

Таким образом, предложенный метод позволяет за короткое время при нормальных условиях провести модификацию поверхности МАLDI-мишени и выполнить пробоподготовку биологических образцов непосредственно на ее поверхности.

Данная работа частично выполнена в рамках гос. задания № 075-00780-19-00 Института аналитического приборостроения РАН, г. Санкт-Петербург.