Модификация метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для количественного определения концентрации ривароксабана в крови
Автор: Драгунова М.А., Моисеева Е.С., Золотухина Н.Ю., Ситкова Е.С., Хлынин М.С., Гуренкова А.А., Гусакова А.М., Баталов Р.Е.
Журнал: Сибирский журнал клинической и экспериментальной медицины @cardiotomsk
Рубрика: Экспериментальные исследования
Статья в выпуске: 4 т.40, 2025 года.
Бесплатный доступ
Введение. Достижение терапевтических концентраций прямых оральных антикоагулянтов (ПОАК) и, соответственно, персонификация антикоагулянтной терапии в определенных группах пациентов становятся все более актуальными. Для оптимизации лекарственного мониторинга в рутинной клинической практике необходима разработка и апробация чувствительных и селективных методик, с помощью которых возможно количественное определение в крови содержания ПОАК, в том числе ривароксабана. Цель исследования: модифицировать метод определения концентрации ривароксабана в крови с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), а также провести апробацию подобранных условий для определения концентрации препарата в цельной венозной крови пациентов. Материал и методы. Для первого этапа работ образцами для исследования являлись пробы крови (n = 20) здоровых добровольцев (n = 5), не принимающих лекарственные препараты. Забор крови из периферической вены осуществляли с использованием вакуумной системы в объеме 6 мл. Пробирки для забора крови использовали с четырьмя разными наполнениями. Перед подготовкой образцы делили на 6 частей и в каждую делали добавку раствора ривароксабана различной концентрации, приготовленного из чистого вещества Rivaroxaban (Индия). Далее проводили жидкостную экстракцию ривароксабана ацетонитрилом из пробы цельной венозной крови с параллельным устранением мешающего влияния белков путем их осаждения хлористым никелем. Разделение компонентов пробы осуществляли методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на жидкостном хроматографе (1260 Infinity II LC). Аналитический сигнал на диодно-матричном детекторе (1260 DAD WR, Agilent Technologies) фиксировали при двух длинах волн – 254 и 280 нм. Для второго этапа работ образцами для исследования являлись пробы цельной венозной крови пациентов (n = 54), принимающих ривароксабан (Bayer, Германия). Забор крови производится утром, натощак, через 12 ч после приема последней дозы препарата (20 мг/сут). Результаты. Авторами были исследованы и установлены факторы, влияющие на уменьшение предела обнаружения ривароксабана в крови при определении его методом ВЭЖХ с использованием жидкостного хроматографа Agilent 1260 с диодно-матричным детектором (Agilent Technologies, Германия). Для оценки степени извлечения ривароксабана и выбора рабочей длины волны были построены градуировочные зависимости антикоагулянта в исходных растворах ацетонитрила и графики изменения площадей пика ривароксабана от его содержания в крови: при длине волны 254 нм (r2 = 0,98) и 280 нм (r2 = 0,99). Функция зависимости при длине волны 254 нм имеет больший угловой коэффициент, что позволяет снизить предел обнаружения определяемого вещества. Содержание диоксида кремния в пробирке не оказывает значимого влияния на аналитический сигнал ривароксабана (минимальное значение пределов обнаружения – 0,25 мкг/мл, минимальное значение пределов определения – 0,77 мкг/мл), а также не вносит дополнительной погрешности в точность метода. Медиана концентрации ривароксабана составила 0,32 мкг/мл (0,26; 0,49) через 12 ч от приема препарата. Заключение. Применение модифицированного метода ВЭЖХ с выбором длины волн 254 нм для детектирования аналитического сигнала позволяет снизить предел обнаружения определяемого вещества и увеличить диапазон определяемых концентраций. Использование пробирок с диоксидом кремния можно рекомендовать для снижения влияния матричного эффекта на количественное определение ривароксабана в крови и увеличения точности метода.
Ривароксабан, антикоагулянтная терапия, высокоэффективная жидкостная хроматография, прямой оральный антикоагулянт
Короткий адрес: https://sciup.org/149150153
IDR: 149150153 | УДК: 615.273:616-005.4:543.544.5 | DOI: 10.29001/2073-8552-2025-2557
Modification of a high-performance liquid chromatography method for quantitative determination of rivaroxaban concentration in blood
Introduction. Achieving therapeutic concentrations of direct oral anticoagulants (DOAC) and, accordingly, personalization of anticoagulant therapy in certain groups of patients are becoming increasingly important. To optimize drug monitoring in routine clinical practice, it is necessary to develop and test sensitive and selective methods that can quantitatively determine the content of DOAC in the blood, including rivaroxaban. Aim: To modify the method for determining the concentration of rivaroxaban in the blood using high-performance liquid chromatography (HPLC), as well as testing the selected conditions for determining the concentration of the drug in the whole venous blood of patients. Material and Methods. For the first stage of the work, the samples for the study were blood samples (n = 20) from healthy volunteers (n = 5) not taking medications. Blood was collected from a peripheral vein using a vacuum system in a volume of 6 ml. Blood collection tubes with four different fillings were used. Before preparation, the samples were divided into 6 parts and each was supplemented with a solution of rivaroxaban of different concentrations, prepared from the pure substance Rivaroxaban (India). Next, liquid extraction of rivaroxaban with acetonitrile from a sample of whole venous blood was carried out with parallel elimination of the interfering effect of proteins by precipitation with nickel chloride. The separation of the sample components was performed by reversed-phase highperformance liquid chromatography on a liquid chromatograph (1260 Infinity II LC). The analytical signal on a diode-array detector (1260 DAD WR, Agilent Technologies) was recorded at two wavelengths of 254 nm and 280 nm. For the second stage of the work, the samples for the study were whole venous blood samples from patients taking rivaroxaban (n = 54). Blood is collected in the morning, on an empty stomach, 12 hours after taking the last dose of the drug. Results. The authors investigated and established the factors influencing the decrease in the detection limit of rivaroxaban (Bayer, Germany) in the blood when determining it by HPLC using an Agilent 1260 liquid chromatograph with a diode array detector (Agilent Technologies, Germany). To assess the degree of rivaroxaban extraction and select the working wavelength, calibration dependences of the anticoagulant in the initial acetonitrile solutions and graphs of changes in the peak areas of rivaroxaban from its content in the blood were constructed: at a wavelength of 254 nm (r2 = 0.98) and 280 nm (r2 = 0.99). The dependence function at a wavelength of 254 nm has a larger slope, which makes it possible to reduce the detection limit of the substance being determined. The silicon dioxide content in the tube does not significantly affect the analytical signal of rivaroxaban (minimum detection limits 0.25 µg/ml, minimum determination limits 0.77 µg/ ml), and does not introduce additional error into the accuracy of the method. The median concentration of rivaroxaban was 0.32 µg/ ml (0.26; 0.49) 12 hours after taking the drug. Conclusion. The use of a modified HPLC method with a wavelength of 254 nm selected for detecting the analytical signal makes it possible to reduce the detection limit of the substance being determined and increase the range of concentrations being determined. And the use of tubes with silicon dioxide can be recommended for decreasing the influence of the matrix effect on the quantitative determination of rivaroxaban in blood and increasing the accuracy of the method.
