Модификация метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для количественного определения концентрации ривароксабана в крови

Введение. Достижение терапевтических концентраций прямых оральных антикоагулянтов (ПОАК) и, соответственно, персонификация антикоагулянтной терапии в определенных группах пациентов становятся все более актуальными. Для оптимизации лекарственного мониторинга в рутинной клинической практике необходима разработка и апробация чувствительных и селективных методик, с помощью которых возможно количественное определение в крови содержания ПОАК, в том числе ривароксабана. Цель исследования: модифицировать метод определения концентрации ривароксабана в крови с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), а также провести апробацию подобранных условий для определения концентрации препарата в цельной венозной крови пациентов. Материал и методы. Для первого этапа работ образцами для исследования являлись пробы крови (n = 20) здоровых добровольцев (n = 5), не принимающих лекарственные препараты. Забор крови из периферической вены осуществляли с использованием вакуумной системы в объеме 6 мл. Пробирки для забора крови использовали с четырьмя разными наполнениями. Перед подготовкой образцы делили на 6 частей и в каждую делали добавку раствора ривароксабана различной концентрации, приготовленного из чистого вещества Rivaroxaban (Индия). Далее проводили жидкостную экстракцию ривароксабана ацетонитрилом из пробы цельной венозной крови с параллельным устранением мешающего влияния белков путем их осаждения хлористым никелем. Разделение компонентов пробы осуществляли методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на жидкостном хроматографе (1260 Infinity II LC). Аналитический сигнал на диодно-матричном детекторе (1260 DAD WR, Agilent Technologies) фиксировали при двух длинах волн – 254 и 280 нм. Для второго этапа работ образцами для исследования являлись пробы цельной венозной крови пациентов (n = 54), принимающих ривароксабан (Bayer, Германия). Забор крови производится утром, натощак, через 12 ч после приема последней дозы препарата (20 мг/сут). Результаты. Авторами были исследованы и установлены факторы, влияющие на уменьшение предела обнаружения ривароксабана в крови при определении его методом ВЭЖХ с использованием жидкостного хроматографа Agilent 1260 с диодно-матричным детектором (Agilent Technologies, Германия). Для оценки степени извлечения ривароксабана и выбора рабочей длины волны были построены градуировочные зависимости антикоагулянта в исходных растворах ацетонитрила и графики изменения площадей пика ривароксабана от его содержания в крови: при длине волны 254 нм (r2 = 0,98) и 280 нм (r2 = 0,99). Функция зависимости при длине волны 254 нм имеет больший угловой коэффициент, что позволяет снизить предел обнаружения определяемого вещества. Содержание диоксида кремния в пробирке не оказывает значимого влияния на аналитический сигнал ривароксабана (минимальное значение пределов обнаружения – 0,25 мкг/мл, минимальное значение пределов определения – 0,77 мкг/мл), а также не вносит дополнительной погрешности в точность метода. Медиана концентрации ривароксабана составила 0,32 мкг/мл (0,26; 0,49) через 12 ч от приема препарата. Заключение. Применение модифицированного метода ВЭЖХ с выбором длины волн 254 нм для детектирования аналитического сигнала позволяет снизить предел обнаружения определяемого вещества и увеличить диапазон определяемых концентраций. Использование пробирок с диоксидом кремния можно рекомендовать для снижения влияния матричного эффекта на количественное определение ривароксабана в крови и увеличения точности метода.