Модификация радиочувствительности овец

В механизмах биологического действия ионизирующих излучений важная роль принадлежит свободнорадикальному перекисному окислению липидов (ПОЛ). Значительный интерес к процессу свободнорадикального ПОЛ обусловлен тем, что он протекает во всех типах клеточных мембран и участвует в регуляции метаболизма клеток. При этом свободные радикалы, наряду с вторичными мессенджерами (ионы Са2+, циклические аденозинмонофосфат и гуанозинмонофосфат (цАМФ и цГМФ), фосфоинозитолы) выполняют функцию регуляторных молекул в биохимических реакциях.

Ранее нами было показано [9], что пролонгированное облучение овец в дозах 0,1 и 0,5 Гр ингибирует интенсивность процесса свободнорадикального ПОЛ в течение всего периода исследования (90 сут) и характеризуется снижением в плазме крови содержания малонового диальдегида, диеновых и триеновых конъюгатов и α-токоферола при одновременном повышении уровня ретинола. В свою очередь, модификация интенсивности процесса свободнорадикального ПОЛ приводит к изменению активности аденилатциклазы и проницаемости плазматической мембраны для ионов Са2+ в клетках периферической крови.

Модификация интенсивности процесса свободнорадикального ПОЛ при воздействии γ-излучения в дозах 0,1 и 0,5 Гр может быть одним из факторов повышения радиорезистентности организма животных к последующему облучению в больших дозах. Поэтому целью исследования стала оценка интенсивности процесса свободнорадикального ПОЛ в плазме крови овец, подвергнутых острому воздействию γ-излучения в сублетальной (2 Гр) и летальной (6 Гр) дозах однократно и повторно после пролонгированного облучения в дозах 0,1 и 0,5 Гр.

Мирзоев Э.Б.* – вед. науч. сотр., д.б.н.; Кобялко В.О. – ст. науч. сотр., к.б.н. ГНУ ВНИИСХРАЭ.

Материалы и методы

Эксперименты были проведены на 23 овцах породы «Прекос» (живая масса 30-37 кг; возраст 1-1,5 года). Животных содержали в условиях вивария ГНУ ВНИИСХРАЭ Россельхозакаде-мии. Рационы овец были сбалансированы по основным питательным веществам согласно нормам ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии [10].

Первая серия экспериментов выполнена на 11 овцах. Две группы подопытных животных (по 4 головы в каждой) через девять месяцев после пролонгированного воздействия Y-излучения в дозах 0,5 и 0,1 Гр, были повторно облучены в сублетальной (2 Гр) и летальной (6 Гр) дозах соответственно. Контрольную группу составили интактные животные (3 головы).

Вторая серия опытов проведена на 12 овцах. Две группы подопытных животных (по 4 головы в каждой) были облучены однократно в сублетальной (2 Гр) и летальной (6 Гр) дозах. Контролем служили интактные животные (4 головы).

Облучение овец проводили на установке ГУЖ-24 с источником излучения 137Cs (энергия Y-квантов 0,67 МэВ). Мощность дозы Y-излучения составляла 1,5 Гр/час. Интенсивность и равномерность облучения контролировали с помощью клинического дозиметра типа 27012 и сферической ионизационной камеры АК-253. Неравномерность облучения не превышала 15%.

Кровь отбирали из яремной вены овец в пробирки с цитратом натрия (конечная концентрация 0,38%) на 1-е, 2-е, 3-и, 5-е, 7-е, 10-е, 15-е, 20-е, 25-е и 30-е сутки. Плазму крови получали общепринятым способом. В плазме крови животных исследовали динамику показателей свободнорадикального ПОЛ: интенсивность спонтанной хемилюминесценции (СХЛ), содержание малонового диальдегида (МДА), диеновых и триеновых конъюгатов (ДК и ТК), а также концентрации а-токоферола и ретинола. Кроме того, учитывали общее состояние животных, реакцию на внешние раздражители, аппетит, функциональное состояние желудочно-кишечного тракта.

Регистрацию СХЛ осуществляли на собранной из стандартных блоков установке, работающей в квантовометрическом режиме и предназначенной для регистрации сверхслабых световых потоков [5]. Содержание продуктов свободнорадикального ПОЛ МДА, ДК и ТК определяли методом спектрометрии [4, 6]. Оптическую плотность образцов измеряли при длине волны Х=532; Х=233; Х=275 нм соответственно. Концентрации а-токоферола и ретинола - микроколо-ночной высокоэффективной жидкостной хроматографии [15].

Результаты обрабатывали методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Различия значений считали достоверными при р<0,05 [7].

Результаты

Лучевое поражение животных сопровождается усилением неферментативных окислительных процессов, возникновением свободных радикалов, гидропероксидов как в липидах, так и водных фазах организма. При активации процесса свободнорадикального ПОЛ возрастает интенсивность хемилюминесценции крови и клеток тканей, которая характеризует окисление белковых, углеводных и липидных компонентов. Кроме того, цепной механизм инициирования этого процесса выявляет многообразие продуктов (МДА, ДК и ТК), количественное определение которых служит оценкой его интенсивности.

Через девять месяцев у овец, подвергнутых пролонгированному воздействию γ-излучения в дозах 0,1 и 0,5 Гр, регистрировали активацию процесса свободнорадикального ПОЛ. Так, интенсивность СХЛ в плазме крови облучённых животных составляла 23,4±6,2 и 25,1±4,8 имп./10 с соответственно, а у интактных – 17,2±0,5 имп./10 с.

Облучение овец в дозе 2 Гр на фоне пролонгированного воздействия γ-излучения в дозе 0,5 Гр ингибировало интенсивность СХЛ в плазме крови (рис. 1). Максимальное уменьшение уровня показателя наблюдали на 5-15-е сутки исследования (34-50% от исходных данных). В то же время однократное острое воздействие в дозе 2 Гр увеличивало интенсивность СХЛ. Величина показателя возрастала на 2-е, 3-и, 20-е и 25-е сутки исследования и составила 162%, 149%, 142% и 161% соответственно (р<0,05).

% от контроля

Сроки исследований, сутки

Рис. 1. Интенсивность СХЛ в плазме крови овец, подвергнутых острому воздействию γ-излучения в сублетальной и летальной дозах однократно и повторно после пролонгированного облучения в дозах 0,5 и 0,1 Гр.

1 – 0,5+2 Гр; 2 – 0,1+6 Гр; 3 – 2 Гр; 4 – 6 Гр; I1 – контроль.

В плазме крови овец, подвергнутых γ-воздействию в летальной дозе (6 Гр) на фоне пролонгированного облучения в дозе 0,1 Гр, наблюдали нелинейный характер изменений интенсивности СХЛ. Так, к исходу вторых суток значение показателя возрастало на 14%, в период с 3 по 15-е сутки регистрировали снижение её уровня в 1,2 и 1,7 раза. В последующие сроки (20-30-е сутки) отмечали некоторое повышение интенсивности СХЛ, хотя значения её были ниже исходных данных. В то же время однократное острое воздействие в летальной дозе (6 Гр) усиливало интенсивность СХЛ в плазме крови на 1-е и 3 сутки после облучения. Максимальное повышение регистрировали на 3 сутки, что составило 142% от исходных данных (p<0,05). В дальнейшем на 5-е и 7-е сутки наблюдали уменьшение уровня показателя с последующим увеличением на 15-25-е сутки (121-138% от исходных данных, p<0,05).

Следовательно, однократное облучение овец в сублетальной (2 Гр) и летальной (6 Гр) дозах приводит к повышению интенсивности СХЛ в плазме крови. Уровень интенсивности её был сравнительно одинаков, однако при облучении овец в дозе 6 Гр отмечали сдвиг максимума значений к начальным срокам исследования. Кроме того, регистрировали снижение величины показателя относительно исходных данных. Напротив, при повторном облучении овец в дозах 2 и 6 Гр после пролонгированного воздействия в дозах 0,5 и 0,1 Гр наблюдали ингибирование интенсивности СХЛ.

Оценка количества промежуточных и конечных продуктов процесса свободнорадикального ПОЛ выявила следующие особенности. Содержание МДА в плазме крови повторно облучённых овец в дозе 2 Гр имело тенденцию к увеличению (рис. 2). В то же время однократное острое воздействие в дозе 2 Гр повышало уровень МДА в плазме крови овец. Максимальные значения отмечали на 7-е и 15-е сутки.

% от

Сроки исследований, сутки

Рис. 2. Концентрация МДА в плазме крови овец, подвергнутых острому воздействию γ-излучения в сублетальной и летальной дозах однократно и повторно после пролонгированного облучения в дозах 0,5 и 0,1 Гр.

1 – 0,5+2 Гр; 2 – 0,1+6 Гр; 3 – 2 Гр; 4 – 6 Гр;        – контроль.

Облучение овец в летальной дозе на фоне пролонгированного воздействия в дозе 0,1 Гр снижало концентрацию МДА в плазме крови в начальные сроки исследования с последующим повышением на 5-30-е сутки. Напротив, однократное острое воздействие в летальной дозе увеличивало значение показателя к исходу вторых сутки. На 3-и, 5-е сутки и последующие сроки исследования регистрировали фазовый характер изменений. Следует отметить, что минимальные значения этого показателя были ниже исходных данных на 13,7%.

Содержание ДК в плазме крови повторно облучённых животных имело тенденцию к снижению (рис. 3). При однократном остром облучении овец в дозе 2 Гр отмечали нелинейный характер изменений. Так, на 1-е сутки исследования регистрировали тенденцию к увеличению значений показателя, а на 2-е и 3 сутки – снижение. Облучение овец в летальной дозе на фоне пролонгированного воздействия в дозе 0,1 Гр выявило достоверное снижение значений показателя на 30-е сутки. В то же время однократное воздействие в летальной дозе (6 Гр) повышало уровень ДК в период с 1 по 15-е сутки развития лучевой патологии.

% от контроля                                    1        2

Сроки исследований, сутки

Рис. 3. Содержание ДК в плазме крови овец, подвергнутых острому воздействию γ-излучения в сублетальной и летальной дозах однократно и повторно после пролонгированного облучения в дозах 0,5 и 0,1 Гр.

1 – 0,5+2 Гр; 2 – 0,1+6 Гр; 3 – 2 Гр; 4 – 6 Гр; I-___J – контроль.

Определение концентрации ТК в плазме крови овец, подвергнутых повторному острому воздействию γ-излучения в дозе 2 Гр, выявило тенденцию к повышению значений показателя (рис. 4). В то же время концентрация ТК в плазме крови однократно облучённых овец возрастала. На 1-е сутки после воздействия в дозе 2 Гр содержание ТК составило 157% (p<0,05). В дальнейшем на 2-е и 3-и сутки регистрировали некоторое уменьшение уровня показателя, хотя его значения были выше исходных на 20% и 27% соответственно. Максимальное увеличение составило 191% на 20-е сутки исследования (p<0,05).

Облучение овец в летальной дозе на фоне пролонгированного воздействия в дозе 0,1 Гр обнаружило тенденцию к снижению уровня ТК. Следует отметить, что динамика значений показателя при повторном облучении носила нелинейный характер. В то же время однократное острое воздействие в летальной дозе (6 Гр) повышало содержание ТК в плазме крови овец. Так, на 1-е сутки после воздействия значение этого показателя составило 256% от исходных данных (p<0,05). В течение всего периода исследования изменения концентрации ТК в плазме крови носили нелинейный характер при максимуме значений на 10-е сутки (488%, p<0,05).

% от контроля

Рис. 4. Содержание ТК в плазме крови овец, подвергнутых острому воздействию γ-излучения в сублетальной и летальной дозах однократно и повторно после пролонгированного облучения в дозах 0,5 и 0,1 Гр.

1 – 0,5+2 Гр; 2 – 0,1+6 Гр; 3 – 2 Гр; 4 – 6 Гр; I____1– контроль.

Процесс свободнорадикального ПОЛ регулируется биоантиоксидантами, к числу которых относят α-токоферол и ретинол. Определение концентрации жирорастворимых витаминов в плазме крови овец, подвергнутых острому воздействию γ-излучения в сублетальной и летальной дозах однократно и повторно после пролонгированного облучения в дозах 0,1 и 0,5 Гр, обнаружило следующие особенности. Так, у овец, облучённых в дозе 2 Гр, на фоне пролонгированного воздействия в дозе 0,5 Гр в течение всего периода исследования не наблюдали существенных изменений концентрации α-токоферола (рис. 5). В то же время однократное облучение овец в дозе 2 Гр повышало уровень α-токоферола в плазме крови. Достоверные различия значений отмечали на 1-е (257%), 5-10-е (245-210%) и 30-е (186%) сутки.

Облучение овец в летальной дозе на фоне пролонгированного воздействия в дозе 0,1 Гр приводило к уменьшению концентрации α-токоферола в плазме крови. Напротив, однократное острое облучение увеличивало уровень α-токоферола в плазме крови. Максимальные значения показателя регистрировали на 2-е (274%, р<0,05), 5-10-е (253-194%, р<0,05) и 30-е (170%, р<0,05) сутки исследования.

% от контроля

Сроки исследований, сутки

Рис. 5. Содержание α-токоферола в плазме крови овец, подвергнутых острому воздействию γ-излучения в сублетальной и летальной дозах однократно и повторно после пролонгированного облучения в дозах 0,5 и 0,1 Гр.

1 – 0,5+2 Гр; 2 – 0,1+6 Гр; 3 – 2 Гр; 4 – 6 Гр;      – контроль.

Содержание ретинола в плазме крови овец, подвергнутых острому воздействию γ-излучения в дозе 2 Гр на фоне пролонгированного облучения в дозе 0,5 Гр, было ниже исходных данных в течение первых 10 суток (рис. 6). В последующие сроки уровень этого показателя возрастал до исходных значений. Однократное острое воздействие γ-излучения в сублетальной дозе (2 Гр) также снижало концентрацию ретинола. Так, на 1-е сутки уменьшение составило 68% (р<0,05), а на 5-7-е сутки – 64-40% (р<0,05). В дальнейшем значения показателя возрастали, хотя и были ниже исходных данных.

Облучение овец в летальной дозе (6 Гр) на фоне пролонгированного воздействия в дозе 0,1 Гр приводило к снижению концентрации ретинола в течение всего срока исследования. В то же время однократное острое воздействие γ-излучения в дозе 6 Гр обнаружило нелинейный характер изменений значений показателя. Содержание ретинола на 2-е сутки было ниже исходных данных на 83,7% (р<0,05), а на 5-7-е сутки – на 59,6-85,1% (р<0,05).

Оценка клинических показателей выявила наиболее короткий латентный период и выраженные симптомы лучевой болезни у овец, однократно облучённых в летальной дозе (6 Гр). Через 3 часа после воздействия наступала вялость, а на 7-е сутки отмечали диарею. К концу исследования фиксировали депрессию и эпиляцию. На 25-е сутки пали две овцы, а на 30-е сутки – остальные. В то же время у животных, облучённых повторно в сублетальной и летальной дозах, после пролонгированного воздействия в малых дозах, отмечали сглаженный характер проявления клинических симптомов. Причём, при повторном облучении в летальной дозе гибели овец не наблюдали.

% от контроля

Сроки исследований, сутки

Рис. 6. Содержание ретинола в плазме крови овец, подвергнутых острому воздействию γ-излучения в сублетальной и летальной дозах однократно и повторно после пролонгированного облучения в дозах 0,5 и 0,1 Гр.

1 – 0,5+2 Гр; 2 – 0,1+6 Гр; 3 – 2 Гр; 4 – 6 Гр; C-’-J – контроль.

Таким образом, при повторном остром воздействии γ-излучения в сублетальной (2 Гр) и летальной (6 Гр) дозах через девять месяцев после пролонгированного облучения овец в дозах 0,5 и 0,1 Гр отсутствовала выраженная активация процесса свободнорадикального ПОЛ. В то же время однократное облучение овец в дозах 2 и 6 Гр инициировало процесс свободнорадикального ПОЛ в плазме крови. Следствием активации процесса свободнорадикального ПОЛ явилось изменение концентрации α-токоферола и ретинола. В целом изменения интенсивности процесса свободнорадикального ПОЛ после однократного воздействия γ-излучения в сублетальной и летальной дозах регистрировали до проявления клинических симптомов лучевой болезни, что позволяет рассматривать их в качестве патогенетического фактора.

Обсуждение результатов

Сравнительный анализ показателей процесса свободнорадикального ПОЛ при однократном и повторном облучении овец в сублетальной и летальной дозах выявил различия. Так, при однократном воздействии отмечали увеличение, а при повторном – уменьшение интенсивности СХЛ. Изменения концентрации продуктов свободнорадикального ПОЛ (МДА, ДК и ТК) в плазме крови повторно облучённых животных носили менее выраженный характер.

Модификация ответной реакции организма при однократном и повторном облучении животных в сублетальной и летальной дозах, вероятно, зависит от исходного уровня показателя. Согласно закону исходного уровня (правило Вильдера): если исходный уровень показателя соответствует нижней границе нормы, то ответная реакция состоит в его повышении до средних величин; если он находится близко к верхней границе нормы – реакция заключается в его снижении; если входит в диапазон средних величин – реакция отсутствует [8].

После пролонгированного облучения овец в дозах 0,1 и 0,5 Гр отмечали ингибирование процесса свободнорадикального ПОЛ, которое, возможно, обусловлено модификацией системы антиоксидантной защиты [1, 13], поэтому можно предположить, что предварительное облучение животных изменяет исходный уровень показателя и «границы нормы реакции».

В целом полученные данные демонстрируют, что пролонгированное воздействие ионизирующим излучением в дозах 0,1 и 0,5 Гр модифицирует ответную реакцию организма овец при повторном облучении в сублетальной и летальной дозах и повышает радиорезистентность организма.

Аналогичные результаты получены на лабораторных животных. Установлено, что предварительное облучение мышей в дозе 0,1 Гр за 5 час до воздействия в повреждающей дозе 2 Гр снижает интенсивность процесса свободнорадикального ПОЛ при одновременном уменьшении количества однонитевых разрывов в ДНК тимоцитов и числа клеток в тимусе [14]. Предполагается, что защитный эффект предварительного воздействия связан не только с активацией ферментов репарации ДНК, но и антиоксидантных систем организма, которые ингибируют процесс свободнорадикального ПОЛ, стабилизируют структуры клеточных мембран и уменьшают вероятность окислительной деструкции молекулы ДНК.

Повышение радиорезистентности организма млекопитающих зависит от большего числа факторов, к числу которых можно отнести величину дозы хронического (пролонгированного) и острого облучения, мощности дозы и время после первого воздействия [16, 17, 19]. Полученные результаты указывают на возможность проявления радиорезистентности и через девять месяцев после предварительного пролонгированного облучения в дозах 0,1 и 0,5 Гр. Необходимо отметить, что повышение радиорезистентности овец при повторном облучении в сублетальной и летальной дозах не является классическим примером проявления индукции адаптивного ответа (АО). Однако механизмы их реализации могут быть схожи.

В настоящее время предложены гипотезы, объясняющие развитие АО в клетках млекопитающих [2, 11, 12]. В качестве пускового события рассматриваются свободнорадикальное перекисное окисление плазматической мембраны клеток и активация рецепторов фактора роста [2].

Передача информации от вторичных посредников, в частности от ионов Са2+ и цАМФ, различным белкам внутри клеток происходит путём их фосфорилирования и осуществляется протеинкиназой С. Предполагается, что при действии ионизирующих излучений в малых дозах активность протеинкиназы С за счёт увеличения пассивной проницаемости мембраны для ионов Са2+ и, соответственно, роста его внутриклеточной концентрации поддерживается аномально продолжительное время, что повышает скорость фосфорилирования клеточных белков.

Возможно, протеинкиназа С выполняет ключевую роль и в индукции АО, так как ингибиторы фермента подавляют его развитие [3]. В свою очередь, протеинкиназа С активирует эндонуклеазу [20], которая повышает резистентность клеток к последующему воздействию ионизирующих излучений в больших дозах [18]. Кроме того, протеинкиназа С участвует в экспрессии генов металлотионеинов, так как ингибиторы фермента блокируют индукцию синтеза мРНК металло-тионеинов, а активаторы, напротив, увеличивают. Дополнительным доказательством является то, что антагонисты ионов Са²⁺ также подавляют развитие АО, индуцированного рентгеновским излучением или H 2 O 2 . Следовательно, полученные нами данные дополняют и подтверждают роль процесса свободнорадикального ПОЛ в повышении радиорезистентности млекопитающих.

Выводы

Показано, что пролонгированное воздействие ионизирующим излучением в дозах 0,1 и 0,5 Гр модифицирует ответную реакцию организма овец при повторном облучении в сублетальной и летальной дозах и повышает радиорезистентность организма. Полученные данные дополняют и подтверждают роль процесса свободнорадикального ПОЛ в модификации радиочувствительности овец и указывают на возможность проявления радиорезистентности через девять месяцев после предварительного пролонгированного облучения в малых дозах.