Модуляция цитотоксического противоопухолевого ответа в культуре мононуклеарных клеток с помощью дендритных клеток

Материал и методы. В работе использована периферическая кровь (25 мл) и образец опухоли (аденокарцинома толстой или прямой кишки) от 6 пациентов, полученный на базе хирургического отделения МКБ №11. Из периферической крови получали мононуклеарные клетки (МНК) на градиенте фиккол-урографина (р=1,077). Далее выделяли моноциты путём адгезии на пластике в течение 2 ч, при 5% СО2 и 37оС. К прилипшей фракции МНК добавлялись 50 нг/мл рчГМ-КСФ, 100 нг/мл рчИЛ-4 на срок 48 ч для получения незрелых ДК. Для презентации антигена брали лизат опухоли из расчёта 100 мкг/мл, который добавляли к незрелым ДК и инкубировали в течение 18–20 ч, контролем были ДК, без введения антигена (ДК0). Для дальнейшего созревания использовали рчФНО-α (25 нг/мл). Далее МНК сокультивировали с ДК, ДК0 в соотношении 10:1. Для сравнения активации лимфоцитов при сокультивировании с ДК в отдельные лунки с МНК и ДК добавляли 10 нг/мл рчИЛ-12 и 100 нг/мл рчИЛ-18. Все образцы делали в дубле (подгруппы – спонтанная и антигенстимулиро- ванная). Через 48 ч во вторые лунки в дублях добавляли лизат опухоли в количестве 100 мкг/мл. Спустя 52 ч проводили тест на цитотоксичность («Promega») МНК к опухолевым клеткам. Созревание ДК оценивалось методом проточной цитофлюорометрии по экспрессии CD14, CD83, CD86, CD11c, HLA-DR и захвату FITC-декстрана ДК. Опухолевые клетки получали путём механической гомогенизации образца опухоли, а лизат опухолевых клеток – путём 3 циклов замораживания-оттаивания с последующим измерением содержания белка по методу Брэдфорд. Статистическую обработку результатов производили с применением непараметрического критерия Манна–Уитни.

Результаты. При культивирования ДК было отмечено увеличение экспрессии маркеров созревания CD86, CD83/CD86, HLA-DR, CD11c и снижение экспрессии CD14 и захвата меченого декстрана, что свидетельствует об эффективности используемого протокола для получения культуры зрелых ДК. Было установлено достоверное увеличение цитотоксичности в культуре МНК при сокультивировании с ДК0 (5,7 vs 30,8%), что указывает на способность ДК, без примирования антигеном, активировать Т-лимфоциты. При этом увеличение цитотоксического ответа при сокультивировании МНК с ДК было больше в 1,6 раза в группе с предварительной активацией ДК опухолевым лизатом. При дополнительной стимуляции Т-клеточного ответа ИЛ-12 и ИЛ-18 было отмечено достоверное увеличение цитотоксичности в группе МНК, по сравнению с аналогичной группой без добавления цитокинов (5,7 vs 26,2%). Следует отметить достоверное увеличение цитотоксичности МНК при сокультивировании с ДК, нагруженных лизатом, и ИЛ-12, ИЛ-18 по срав- нению с ДК без дополнительной стимуляции цитокинами (44,9 vs 66,5%).

Выводы. Показано, что зрелые ДК, нагруженные опухолевым лизатом, в сочетании с

ИЛ-12 и ИЛ-18 достоверно стимулируют цитотоксичность лимфоцитов к опухолевым клеткам больных колоректальным раком по сравнению с группами контроля.