Модуляция противоопухолевого иммунного ответа аутологичными активированными дендритными клетками при раке яичника in vitro

ГУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН, г. Новосибирск1

Городская клиническая больница №1, г. Новосибирск2

Актуальность. Несмотря на огромное количество разрабатываемых и используемых методов лечения онкологических заболеваний эта проблема до сих пор остается практически не решенной. Уже более 100 лет повышенный интерес вызывает вопрос об эффективности иммунного ответа на опухоль у человека. Одной из гипотез возникновения злокачественного процесса является несостоятельность иммунной системы. В последнее время стало ясно, что в процессе опухолевой прогрессии важную роль играют дендритные клетки (ДК). Установлено, что по причине отсутствия ДК в опухоли или слабой экспрессии молекул МНС 1-го и 2-го классов, а также CD80 и CD86 костимули-рующих молекул на ДК, инфильтрирующих опухоль, не создается устойчивый антигенспе-цифический Т-клеточный ответ. По мнению ряда авторов, это может быть следствием продукции злокачественной опухолью факторов (ИЛ-10, ТФР-бета, фактор роста эндотелия и др), угнетающих дифференцировку, созревание и функциональную активность периферических ДК. В последнее время ДК рассматривают в качестве основного адъюванта при создании вакцин для лечения рака, а также при микробных инфекциях, аутоиммунных заболеваниях, трансплантации.

В связи с этим цель исследования – разработать протокол модуляции специфического противоопухолевого иммунного ответа с использованием аутологичных дендритных клеток, презентирующих антигены опухолевого лизата, и оценить их эффективность in vitro.

Материал и методы. Объект исследования ДК и мононуклеарные клетки периферической крови (МНК) больных раком яичника (12 человек) для разработки и оптимизации протоколов их получения и изучения возможностей иммунокоррекции. Из них 7 человек имели папиллярно-железистый рак яичника, 1 – солидно-железистый рак, 1 – мезонефроидный рак, 1 – эндометриодный рак, 1 – недифференцированную карциному, 1 – умереннодифференцированную аденокарциному. Приготовление лизата опухолевой ткани: опухоль гомогенизировали в забуференном физиологическом растворе, полученный раствор замораживался при температуре -70°С и проводился через 3 цикла быстрого оттаивания на водяной бане +37°С и быстрой заморозки. Полученный гомогенат центрифугировали при 12000G 15 мин, супернатант собирали, измеряли концентрацию белка и замораживали до дальнейшего использования при –20°С. Получение ДК. МНК выделялись методом центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографина (ρ=1,082). Популяция, используемая для получения ДК, выделялась методом адгезии на пластике (Nunc, Denmark) из МНК. Полученные клетки культивировались в присутствии GM-CSF (50 нг /мл) и IL-4 (100 нг/мл) в течение 24 часов. Инкубация с лизатом опухоли (100 мкг/мл) продолжалась 16–18 часов, а созревание в присутствии TNFб (25 нг/мл) – 24 часа. Проточная цитофлуорометрия. Для идентификации популяции ДК использовалась оценка способности незрелых ДК к эндоцитозу декстрана (Sigma, USA) и экспрессия маркеров CD83, CD86 (Becton Dickinson, USA) и HLA-DR(Сорбент, Москва) зрелыми ДК. Анализ проводился на приборе FACSCalibur (Becton Dickinson, USA). Пролиферация оценивалась на

Результаты. Функциональная активность незрелых ДК определялась по захвату декстрана. Признаком функциональной зрелости считали повышение уровня экспрессии маркеров CD83, CD86, HLA-DR. Применение антиген-активиро-ванных ДК для обучения МНК распознаванию специфического антигена приводит к увеличению количества IFN-г-продуцирующих клеток в ответ на лизат опухолевой ткани, с 18,1 ± 4,9 клеток на 1х105 исходной популяции до 32,4 ± 6,8 для «обученных» МНК. Также в ответ на антигены опухоли, представленные лизатом, увеличивается уровень пролиферации «обученных» МНК с 380,1 ± 115,5 имп/мин в исходной популяции до 1437,7 ± 201,9 имп/мин для «обученных» МНК (рWilkoxon=0,04). Применение ИЛ-18 при совместном культивировании ДК с МНК периферической крови больных раком яичника приводит к увеличению секреции IFN-г без выраженной стимуляции пролиферативной реакции МНК.

Выводы. В результате проведенных исследований разработан протокол получения функционально активных зрелых ДК, презентирующих антигены опухолевых лизатов. Полученные зрелые ДК способны активировать неспецифическую и специфическую функциональную активность МНК периферической крови онкологических больных, в частности, усиливать пролиферативный ответ и стимулировать продукцию ИФНг. Использование рекомбинантного интерлейкина-18 при совместном культивировании мононуклеарных и дендритных клеток приводит к увеличению количества клеток, продуцирующих ИФНг, который является важным фактором противоопухолевой защиты и продуцируется цитотоксическими лимфоцитами и натуральными киллерными клетками.