Модуляция жизнеспособности клеток, иммобилизованных в пористо-проницаемом инкубаторе из никелида титана, под действием инфракрасного и ультрафиолетового излучений

Введение в практику экспериментальной биологии и медицины методов длительного культивирования клеток, в том числе клеток-предшественников специализированных тканей, создало предпосылки для разработки новых технологий заместительной клеточной и тканевой терапии и конструирования биоискусственных органов [1, 2].

Ответственный этап использования культивированных клеток – трансплантация в зону повреждения. Успех предшествующей работы и эффект лечения зависят от того, какая часть клеток попадет в зону дефекта, адгезируют ли культивированные клетки к тканям, сохранят ли они активное функциональное состояние. С точки зрения создания технологии пересадки выращенных in vitro клеток немаловажно обеспечение оптимальных условий реципиентного ложа. Проблемой остается длительное сохранение функциональной активности имплантированных клеток in vivo. Простое введение суспензии клеток-предшественников оказалось малоэффективным, поэтому возникла необходимость поиска адекватного носителя для трансплантации клеток в организм реципиента [3–7].

Используемый клеточной и тканевой инженерией междисциплинарный подход направлен в первую очередь на создание композиционных материалов для восстановления утраченных функций отдельных тканей или органов в целом. Основные принципы этого подхода заключаются в разработке и применении при имплантации в поврежденный орган или ткань носителей из различных биоматериалов, которые используются в сочетании с донорскими клетками и/или биоактивными веществами [8–9].

Материалы, применяемые в тканевой инженерии, должны обладать широким спектром специфических свойств. До тех пор пока новая ткань организма-хозяина в месте имплантации полностью не восстановится,

материал, применяемый для изготовления конструкции, должен поддерживать рост клеток и их организацию в ткань, а имплантат – беспрепятственно отводить продукты обмена клеток [8].

Матриксы (скаффолды) должны обладать многофункциональностью: эластичностью и механической прочностью; биосовместимостью на белковом и клеточном уровне; способностью создавать условия для прикрепления клеток и стимулировать пролиферацию и дифференциацию клеток; возможностью стерилизации без изменения медико-технических свойств. Для реализации потенциала культивированные клетки, организованные в сложные трехмерные структуры, должны определенное время находиться в зафиксированном к носителю состоянии [8–10].

В последние годы активно используют пористо-проницаемые инкубаторы из никелида титана в конструировании биосовместимых матриксов применительно к задачам тканевой инженерии и трансплантологии. Многообещающей является перспектива использования биоматриксов для регенерации поврежденных опухолями и другими этиологиями тканей желез и печени, изготовления биоимплантатов кровеносных сосудов и воздухоносных путей, закрытия дефектов мягких и костных тканей [11– 14].

Методы выделения необходимого количества жизнеспособных клеток не всегда обеспечивают нужный результат, при этом качество взятой у больного ткани различно и зависит от многих причин: степени заболевания пациента, возраста, количества пунктата и т. д. Одна из актуальных проблем клеточной трансплантологии – достижение необходимого количества жизнеспособных клеток для трансплантации. Исследователи эту проблему решают различными путями: совершенствованием методов выделения клеток, увеличением количества взятого биоматериала, применением различных биостимуляторов роста и пролиферации с использованием как химических, так и физических факторов [15–17].

Сложным и важным физическим фактором, воздействующим на клеточные процессы, является электромагнитное излучение. Биологическое поле клеток постоянно изменяется под действием различных видов электромагнитного излучения, существующих как между клетками и тканями, так и с пространством биосферы. Незначительные вариации параметров облучения могут вызывать изменение реакции клеток, вплоть до их гибели, поэтому какая-либо некорректность постановки опыта и задания начальных условий иссле- дования может привести к недостоверным результатам [18, 19].

Электромагнитные волны модифицируют состояние билипидной клеточной мембраны, усиливая или уменьшая проникновение воды в цитоплазму клетки, при этом изменяя поляризацию мембраны и тем самым сигнальную систему клетки. Эти эффекты заметны при увеличении интенсивности излучения – улучшение циркуляции крови в капиллярах и т. д. [20, 21].

При воздействии на ткани инфракрасного (ИК) излучения происходит его поглощение молекулами воды, кислородом, ферментами, мембранами клеток и другими структурами. Выделяющееся при излучении тепло увеличивает колебательную энергию молекул, изменяя процессы в термодинамической системе. Под действием ИК-излучения усиливается биологическая активность клеток, ускоряется кровоток, повышается деятельность желез, снимается мышечный спазм, снижается болевой синдром и т. д. [22, 23].

Под влиянием ультрафиолетового (УФ) излучения изменяются свойства биополимеров – белков и нуклеиновых кислот. Молекулы биополимеров содержат кольцевые группы молекул, которые интенсивно резонируют, то есть поглощают излучение с короткой длиной волны (около 280 нм). Эта поглощенная энергия может передаваться по цепи атомов в пределах молекулы без существенной потери, пока не достигнет слабых связей между атомами и не разрушит их. В течение такого процесса, называемого фотолизом, образуются части молекул, радикалы и ионы, воздействующие на клеточные структуры. Примером служит денатурация белков под действием ультрафиолетового излучения. УФ-излучение, взаимодействуя с веществом, в том числе органическим, часто вызывает его ионизацию, так называемый фотоэлектрический эффект, нарушающий биохимические реакции в клетках. [24]. Таким образом, реакция клеток на электромагнитное воздействие индивидуальна и зависит от множества факторов, включая клеточное микроокружение.

Цель работы – исследование воздействия электромагнитных волн УФ (370 нм) и ИК (860 нм) диапазонов малой интенсивности на клетки различных биологических тканей (селезенки, костного мозга и аденокарциномы Эрлиха), иммобилизованные в пористо-проницаемом инкубаторе из никелида титана (патент на изобретение № 2438699 «Способ изготовления вакцины для лечения аденокарциномы Эрлиха в эксперименте» от 10.01.2012) [25]. В работе поставлены задачи: определить степень воздействия излучения малой интенсивности на клеточную суспензию и

Рис. 1. Пористо-проницаемые инкубаторы из никелида титана, применяемые в клеточной терапии: а – инкубаторы; б – единичный инкубатор

б

Размер:

2,5 х 2,5 х 4 мм

провести сравнительный анализ жизнеспособности клеток, иммобилизованных в пористо-проницаемом никелиде титана, при ИК- и УФ-облучениях.

Материал и методы

В работе использовали пористо-проницаемые инкубаторы из никелида титана, разработанные в НИИ медицинских материалов и имплантатов с памятью формы (Томск, Россия).

Пористые инкубаторы получены методом саморас-пространяющегося высокотемпературного синтеза с проницаемой пористостью около 70%. Инкубаторы вырезаны электроэрозионным способом из медицинского сплава ТН-10 (рис. 1).

Топографию поверхности образцов и структуру порового пространства изучали с использованием растрового электронного микроскопа Quanta 200 3D.

Животные – мыши С57BL\6, массой 20–24 г, возраст 18–12 недель, самцы.

Опухоль – карцинома Эрлиха (асцитный вариант), доза перевивки 5 х 106 клеток.

Выделяли клетки из асцетической жидкости мышей C57BL/6 методом центрифугирования. Затем ресуспен-дировали в полной культуральной среде, состоящей из среды RPMI-1640 (ООО «Панэко», Москва) c 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 250 мг/л глутамина и 40 мкг/мл гентамицина (ООО «Панэко», Москва). В аналогичной среде использовали клетки костного мозга и селезенки мышей C57BL/6, полученные по соответствующим методикам.

Раскапывали клетки в 96-луночный планшет по 2 х 105 клеток на лунку, сверху размещали конструк- цию со встроенными светодиодами необходимой длины волны. Облучение проводили на расстоянии 1 см от поверхности жидкости. Культивировали клетки необходимое время в светонепроницаемом СО2-ин-кубаторе при 37 °C и 100% влажности. По окончании культивирования подсчитывали их жизнеспособность с помощью трипанового синего. Для каждого светодиода отводили 3 лунки с образцами клеточной суспензии. Предварительно в опытные лунки добавляли стерильные образцы из пористо-проницаемого никелида титана размером 2,5 х 2,5 х 2 мм, составляющие приблизительно 1/10 культурального объема.

Группы сравнения: первая (контроль) – процент жизнеспособных клеток в культуральной среде; вторая – процент жизнеспособных клеток в присутствии пористого никелида титана; третья – процент жизнеспособных клеток после облучения ИК-спектром малой интенсивности в присутствии пористого никелида титана (контрольная культура облучалась аналогичное время дневным искусственным светом); четвертая – процент жизнеспособных клеток после облучения УФ-спектром малой интенсивности в присутствии пористого никелида титана (контрольную культуру облучали аналогичное время дневным искусственным светом).

Воздействие облучения на клетки и образцы инкубаторов осуществлялось светодиодами типа L-53SF6C (ИК-излучение) и LLT-UVLED11 (УФ-излучение) (Китай) в течение 4 ч при мощности излучения 4–6 мВт/см2 и последующим адаптационным периодом 20 ч. После 30 мин обработки 0,25% раствором трипсина-ЭДТА планшеты центрифугировались. Ресуспендировали клеточные суспензии и подсчитывали количество жизнеспособных клеток с помощью 0,4% трипанового сине-

Рис. 2. Клетки на поверхности образца из никелида титана (SEM) на 7-е сутки после засева: а – селезеночные; б – опухолевые

го. Далее вычисляли процент трипаннегативных клеток от общего количества и анализировали данные статистически.

Статистическую обработку проводили общепринятыми методами с помощью программного пакета Statistica 6.0. Поскольку в исследовании присутствовали выборки, закон распределения числовых показателей в которых отличался от нормального, по данным проверки при помощи критерия Колмогорова – Смирнова, до- стоверность различий изучаемых признаков проверяли при помощи непараметрического U-критерия Манна – Уитни (попарные сравнения независимых совокупностей показателей).

Результаты

Исследования взаимодействия различных клеток с поверхностью пористо-проницаемого никелида титана показали, что поверхность материала является ад-

• Селезенка

■ Опухоль Эрлиха

-A- Костный мозг

Рис. 3. Жизнеспособность клеток-мишеней при воздействии излучения различных длин волн малой интенсивности в течение 4 ч

Рис. 4. Сравнение искусственного дневного облучения клеточных популяций с ИК- и УФ-спектрами

• • Опухоль Эрлиха

• ■ Селезенка

Костный мозг гезирующей и биосовместимой с этим типом клеток подложкой. На внутренней поверхности образцов из никелида титана наблюдали прикрепленные размножающиеся клетки (рис. 2). Опухолевые клетки активно росли и размножались в пористом пространстве инкубатора из никелида титана и заполняли все поры инкубатора в течение 28–30 суток в условиях in vitro.

В исследованиях по влиянию ИК- и УФ-облучений на клетки опухоли Эрлиха, селезенки и костного мозга мышей линии С57BL/6 отмечено, что значимые показатели прослеживаются при воздействии излучения на клетки более 4 ч (рис. 3).

При воздействии ИК-излучения малой интенсивности на все исследуемые популяции клеток наблюдается достоверное повышение количества жизнеспособных клеток по сравнению с искусственным дневным облучением. При УФ-излучении – достоверное снижение жизнеспособности клеточных популяций (рис. 4).

В организме человека клеточное микроокружение и глубина залегания клеток от поверхности играют основную роль в защите от различного вида излучений. Мы попытались охарактеризовать действие ИК- и УФ-излучений на клеточные суспензии, иммобилизованные в пористо-проницаемом никелиде титана.

Отмечено достоверное изменение жизнеспособности клеточных культур в культуральной среде пористого никелида титана с последующим действием излучения. В эксперименте получено однонаправленное действие обоих излучений диапазона волн: инфракрас- ное излучение вызывает увеличение жизнеспособности клеток опухоли Эрлиха, костного мозга и селезенки в 4,6, 2,5 и 1,3 раза, ультрафиолетовое – в 3,9, 1,5 и 1,2 раза соответственно по сравнению с контрольной, в которой инкубировали клетки только при естественном освещении (рис. 5).

Такая реакция клеток на ИК- и УФ-излучения связана с преобразованием энергии спектров излучений в тепловую энергию пористых инкубаторов из никелида титана. При этом происходит сглаживание тепловой энергии в водной среде инкубатора, проявляющееся в возникновении «мягкого» градиента воздействия температуры на клеточную пролиферацию. Инфракрасное и ультрафиолетовое излучения нагревают стенки пор инкубатора и матричную основу, а жидкая окружающая среда за счет проницаемой структуры инкубатора не позволяет разогреваться до критических (для клеток) температур (43–45 °С), что оказывает благоприятное воздействие на процессы клеточной пролиферации (быстроделящихся) стволовых и опухолевых типов клеток. Более того, пористый инкубатор создает экран от прямого воздействия ультрафиолетовых лучей, предохраняя клетки от деградирующего влияния.

Заключение

Полученные данные показывают, что ИК- и УФ-излучения малой интенсивности изменяют жизнеспособность клеток и численность клеточных популяций костного мозга, опухолевых клеток и клеток селезенки:

■ Опухоль Эрлиха

Костный мозг

■ Селезенка

Группа

Рис. 5. Зависимость жизнеспособных клеток опухоли Эрлиха, костного мозга и селезенки от типа воздействия в различных условиях: 1 – питательной среде; 2 – пористых инкубаторах из никелида титана без облучения; 3 – пористых инкубаторах из нике-лида титана после инфракрасного облучения; 4 – пористых инкубаторах из никелида титана после ультрафиолетового облучения

активно повышают (ИК-спектр) или подавляют пролиферативную активность (УФ-спектр).

Эффект воздействия ИК-спектра можно применять в реанимации популяции клеток после выделения из тканевых структур для увеличения количества малочисленной популяции до необходимой величины. Также действие УФ-спектра, возможно, найдет применение в уничтожении остаточных опухолевых очагов или других патологических клеточных популяций.

Присутствие пористо-проницаемых инкубаторов из никелида титана изменяет параметры взаимодействия клеток костного мозга, опухолевых клеток и клеток селезенки с внешней средой, увеличивая их жизнеспособность и пролиферативные потенции. Даже клеточные популяции при УФ-облучении в условиях пористого инкубатора изменяют модуль жизнеспособности на положительный. Аналогичный эффект можно наблюдать и в живых организмах при ультрафиолетовом излучении.

Результаты данного исследования используют при разработке инкубаторов-носителей клеточных культур с размещением в матричной пористой структуре инкубатора миниатюрного генератора электромагнитного излучения с заданными параметрами воздействия.

Работа выполнена при поддержке программы «Научный фонд им. Д.И. Менделеева Национального исследо- вательского Томского государственного университета» (№ проекта 8.1.42.2015).