Молекулярная диагностика заражения некоторых молдавских сортов томата фитоплазмой

Vegetable crops of Russia. 2020;(4):88-92. (In Russ.)

Столбур – одно из распространенных заболеваний томата, вызываемое фитопатогеном ʹCandidatus Phytoplasma solaniʹ. Оно существенно поражает расте- ния, приводя к значительным экономическим потерям за счёт снижения количества и качества продукции [1]. Данное заболевание характеризуется рядом симптомов, таких как карликовость растений, позеленение и срастание лепестков, одревеснение стеблей и плодов. На стеблях могут формироваться уплотнения (узелки), плоды пораженных растений становятся мельче и имеют характерную ребристость. Симптомы фитоплазменной инфекции становится заметными на поздних стадиях развития растений, когда имеет место системное заражение [2]. Основными переносчиками столбура являются насекомые из семейств Psyllidae, Cicadelidae и Cixiidae [3]. Сорняки также влияют на распространение фитоплазмы, являясь промежуточным хозяином, на котором зимуют насекомые-векторы [4].

Морфологическая диагностика столбура возможна на сравнительно поздних стадиях развития растений, когда проявляются специфические признаки заболевания. Таким образом, определение заражения в начале болезни затрудненно [5]. Также идентификацию фитоплазмы ских сортов томата на разных стадиях развития растений.

Материалы и методы

Молекулярная диагностика ʹ Candidatus Phytoplasma solaniʹ проводилась на растениях томата, выращиваемых в поле. Был проведен анализ и сравнение результатов, полученных в течение двух сезонов вегетации – 2018 и 2019 годов. Схема исследований в целом была сходной в оба сезона. Были проанализированы томаты 4 сортов: Elvira, Cerasus, Mary Gratefully и Desteptarea, созданные в Институте Генетики, Физиологии и Защиты Растений (Кишинев, Молдова). В сезоне 2019 года в схему экспериментов была дополнительно включена дикая форма томата Solanum habrochaites , которая, как предполагалась, могла служить в качестве контрольного варианта. Для анализа в начале полевого сезона были выбраны в случайном порядке и пронумерованы по 20 (2018 год) или 12 (2019 год) растений из каждого генотипа. Исследования проводили на разных стадиях развития этих растений в период вегетации с июля по сентябрь. ДНК для молекулярного анализа выделяли из отдельных растений с помощью щелочного экспресс метода [14]. Материалом для выделения ДНК служили тонкие срезы плодоножек. Молекулярную диагностику фитоплазменной инфекций проводили с помощью нестед-ПЦР анализа с использованием

Таблица 1. Праймеры для определения ʹ Candidatus Phytoplasma solani ʹ Table 1. Primers for ʹ Candidatus Phytoplasma solani ʹ identification

Праймер 5 -3 последовательность Раунд Фрагмент, п.н. Т пл. °C cpn421F AGCGCAAAGTATGATTCATCGTGG 1 421 60 cpn421R AAGAGGTAAAATTTCTTGGATCGTGC 1 61 cpn200F TTAAAGAAGGGATCGAACTTGC 2 200 59 cpn200R AAAACTTTTGGACTCATCGACA 2 60 затрудняет невозможность культивирования ее в условиях in vitro [6,7]. В то же время, молекулярные методы позволяют достоверно и быстро определять появление фитоплазменной инфекции на начальных стадиях развития растений. Одним из преимуществ использования молекулярной диагностики, в особенности нестед-ПЦР анализа, является возможность определения заражения даже тогда, когда титр ДНК фитопатогена в пробах не высок [8,9].

Основными мерами борьбы со столбуром служат обработки полей инсектицидами, гербицидами, антибактериальными препаратами, а также применение некоторых других агрономических приемов. Данные меры позволяют уменьшить ущерб от болезни, но оказывают негативное действие на окружающую среду и здоровье человека [10]. Одним из перспективных путей в борьбе со столбуром является создание и использование устойчивых к фитоплазме сортов томата. Следует подчеркнуть, что селекция томата на невосприимчивость к заражению фитоплазмой имеет ряд преимуществ как с точки зрения экономики, так и экологии [11,12]. Использование при этом молекулярных методов диагностики, в особенности ПЦР анализа, позволяет в более короткий срок и более точно осуществлять определение степени заражения селекционного материала и полученных в результате селекции сортов томата [13].

Основной целью представленной работы являлось использование молекулярной диагностики ʹCa. P. solaniʹ для сравнения степени заражения некоторых молдав- специфичных для ʹCa. P. solaniʹ праймеров, созданных на основе нуклеотидной последовательности шаперонинового гена (табл. 1).

Программа амплификации была следующей: I – 94°C 5'; II – 94°C 30'', 58°C 30'', 72°C 30'' x 30 (1 раунд) или x35 (2 раунд); III – 72°C 10'; IV – 4°C ∞ . Визуализацию результатов ПЦР проводили с помощью электрофореза амплифицированных фрагментов, окрашенных бромистым этидием, в 1,5% агарозном геле (буферный раствор 1xTBE). Размер полученных фрагментов определяли с помощью маркера длин фрагментов ДНК O’Gene Ruler 100 bp DNA Ladder Plus в ультрафиолете. Статистическая обработка данных была выполнена с использованием критерия Фишера.

Результаты и обсуждение

Молекулярную диагностику ʹ Candidatus Phytoplasma solaniʹ на томатах проводили на трех стадиях развития растений: в июле – на стадии начала созревания плодов, в августе – на стадии массового созревания плодов, и в сентябре – в конце вегетационного периода после сбора значительной части урожая плодов.

Важно отметить, что климатические показатели лета 2019 года (сильная жара и засуха) были не слишком благоприятными, что повлияло на более позднее развитие растений и смещение фаз роста и развития томатов по сравнению с предыдущим, 2018, годом, который был жарким, но с нормальным количеством осадков в середине лета. Данные изменения учитывались при сборе растительного материала и последующем анализе.

Рис.1. Результаты нестед-ПЦР анализа для определения ʹCa. P. solaniʹ (фрагмент 200 п.н.) на ДНК, выделенной из плодоножек четырех сортов томата в разные периоды развития растений (сезон вегетации 2019 года)

Fig.1. Results of nested-PCR analysis (fragment 200 b.p.) for ʹCa. P. solaniʹ detection at DNA extracted from tomato peduncles at different stages of plants development (growing season of 2019)

Для учета количества зараженных растений в каждом генотипе число фрагментов (ампликонов длиной 200 п.н., являющихся положительным сигналом заражения растения фитоплазмой) на электрофореграммах подсчитывалось отдельно по сезонам вегетации и месяцам сбора растительного материала, суммировалось и сравнивалось. На рисунке 1 в качестве примера представлены результаты молекулярной диагностики ʹCa. P. solaniʹ у томатов 4 сортов молдавской селекции в 2019 году. Результаты нестед-ПЦР анализа дикой формы Solanum habrochaites не представлены на рисунке 1, так как фрагмент размером 200 п.н. не был обнаружен ни на одном из соответствующих агарозных гелей.

Прежде всего, было проанализировано и сравнивалось распространение столбура на томатном поле в целом, без учета сортов, в течение периодов вегетации 2018 и 2019 годов (рис. 2). Сравнивая суммарные данные по распространению фитоплазмы на томатном поле, полученные в течение 2018 и 2019 годов, можно заметить, что разница между уровнем зараженности растений не была очень значительной, будучи максимальной в июле, на стадии начала созревания плодов. А именно, процент зараженности томатов ʹCa . P. solaniʹ в июле 2019 года был выше, чем в июле 2018 года, однако в дальнейшем процент инфицированных растений в 2019 году не увеличивался в той же степени, что в 2018 году. Это может быть обусловлено тем, что высокие температуры в сочетании с сильной засухой негативно повлияли не только на разви-

Рис. 2. Суммарные данные по распространению ʹCa. P. solaniʹ на томатном поле в 2018 и 2019 годах

Fig. 2. Summarized data of the spread of ʹCa. P. solaniʹ in tomato field in 2018 and 2019

тие растений, но и на активность насекомых-переносчиков, что снизило последующее распространение инфекции в августе-сентябре 2019 года.

Детальный анализ распространения столбура среди растений томата отдельных сортов позволил выявить существенную разницу в чувствительности этих сортов к фитоплазменной инфекции, причем разница наблюдалась в течение обоих сезонов вегетации. В таблице 2 представлены данные, полученные в результате молекулярной

Таблица 2. Результаты идентификации фитоплазменной инфекции в растениях разных генотипов томата в 2018 и 2019 году

Table 2. Results of the identification of phytoplasma infection in plants of different tomato genotypes in 2018 and 2019

Сорт	Степень распространения заболевания на поле (%)
	2018			2019
	Июль	Август	Сентябрь	Июль	Август	Сентябрь
Elvira	35	85	85	25	50	58
Cerasus	5	35	55	25	25	58
Mary Gratefully	ХХ	50	70	50	92	92
Desteptarea	30	80	80	50	58	58
Solanum habrochaites	ХХ	ХХ	ХХ	0	0	0

ХХ - молекулярная диагностика фитоплазменной инфекции в данных вариантах не проводилась идентификации инфекции ʹCa. P. solaniʹ в растениях томата пяти изучаемых генотипов на разных стадиях сезонов вегетации 2018 года и 2019 года.

То, что инфекция ʹCa. P. solaniʹ вообще не была обнаружена в растениях дикой формы Solanum habrochaites в течение всего сезона вегетации, является важным результатом. Невосприимчивость растений дикой формы томата к заражению фитоплазмой может быть обусловлена как морфофизиологическими особенностями, такими как густое опушение стеблей и листьев, являющееся механическим барьером для мелких насекомых-переносчиков, так и возможной выработкой растениями специфических репеллентов, являющихся токсичными для этих насекомых [15]. Следовательно, Solanum habrochaites может быть использован в будущем при оценке чувствительности сортов и гибридов томата к ʹCa. P. solaniʹ в качестве конт- рольного варианта. Также полезным представляется использование этого генотипа селекционерами в качестве материала для гибридизации при создании устойчивых к фитоплазме сортов.

Молекулярная диагностика зараженности четырех сортов томата фитоплазмой в течение двух сезонов вегетации продемонстрировала выраженные различия. В июле 2019 года, на стадии начала созревания плодов, половина растений двух сортов томата, Desteptarea и Mary Gratefully, была поражена столбуром. В сортах Elvira и Cerasus процент зараженных растений был значительно ниже, составляя всего 25%. В условиях 2018 года очень незначительное заражение было зафиксировано у сорта Cerasus (5%) и меньший процент зараженных растений наблюдался у сорта Desteptarea (30% в 2018 году против 50% зараженных растений в 2019 году).

Наибольшие различия между степенью зараженности растений разных сортов томата фитоплазмой наблюдались в период массового созревания плодов, в августе, причем влияние условий года на реакцию растений разных сортов было неоднозначным (см. табл.2, рис. 3).

Desteptarea почти не менялся, достигнув одинаковых 58% в 2019 году и около 80-85% – в 2018 году. До этого же уровня в 58%, но более чем в два раза по сравнению с июлем и августом, увеличилось заражение растений сорта Cerasus в сентябре 2019 года. В 2018 году на этом сорте был зафиксирован сходный показатель заражения – около 55%. Процент пораженных столбуром растений сорта Mary Gratefully сохранился к концу вегетационного периода 2019 года на том же высоком уровне, как и в период массового созревания (92%). В условиях 2018 года процент зараженных растений у сорта томата Mary Gratefully в сентябре увеличился до 85%.

Итак, молекулярная диагностика распространения инфекции ʹCa. P. solaniʹ на томатном поле в условиях жаркого и засушливого лета 2019 года показала, что у трех из четырех изученных сортов (Elvira, Desteptarea и Mary Gratefully) максимальные значения уровня заражения были зафиксированы на стадии массового созревания плодов, в августе, и они не увеличивались до конца вегетационного сезона (середина сентября). Схожие результаты были получены у сортов Elvira и Desteptarea в 2018 году, когда

Рис. 3. Распространение ʹCa. P. solaniʹ на томатном поле в период массового созревания плодов, в августе 2018 и 2019 годов Fig.3. Spread of ʹCa. P. solaniʹ in tomato field at the period of mass fruit ripening, in august of 2018 and 2019

В 2018 году сорта Elvira и Desteptarea были более существенно поражены фитоплазменной инфекцией, что составило 85% и 80%, соответственно. Сорт томата Mary Gratefully продемонстрировал более низкие показатели заражения в сравнении с 2019 годом – только половина растений этого сорта была заражена ʹCa. P. solaniʹ. Низкий процент заражения растений фитоплазменой инфекцией наблюдался также в сорте Cerasus (35%). В августе 2019 года, на стадии массового созревания плодов, количество зараженных фитоплазмой растений сорта Desteptarea возросло, в отличие от 2018 года, незначительно, достигнув уровня 58%. У сорта Elvira процент зараженных растений увеличился в августе 2019 года вдвое, достигнув 50%, что тоже было меньше, чем в 2018 году. Таким образом, динамика распространения инфекции между растениями сортов Desteptarea и Elvira совпадала и погодные условия года (сезона вегетации) влияли на распространение фитоплазмы у этих сортов одинаковым образом. В то же время, процент инфицированных фитоплазмой растений томата сорта Mary Gratefully увеличился в неблагоприятных условиях 2019 года резко, составив более 90% (P 0.05). И только у сорта Cerasus количество зараженных растений практически не изменилось: как и в июле, всего четверть растений сорта Cerasus была поражена столбуром в августе 2019 года. Таким образом, сорт Cerasus проявил большую устойчивость к заражению ʹCa. P. solaniʹ по сравнению с другими сортами томата, что хорошо согласуется с результатами, полученными в прошлые годы [16].

В конце вегетационного периода, в сентябре, уровень заражения фитоплазмой сортов томата Elvira и высокие температурные показатели летом сочетались с нормальным количеством осадков. У сорта Cerasus, проявившего себя менее чувствительным к заражению фитоплазмой в июле и августе 2018 и 2019 годов, к концу вегетационного периода наблюдалось некоторое увеличение числа зараженных растений, но почти половина растений в поле осталась здоровой. Однако после периода массового созревания и сбора основного урожая плодов, которое имело место в августе, заражение растений сорта Cerasus в сентябре не могло существенно ухудшить показатели продуктивности и товарности плодов. Несомненно, сорт Cerasus, наряду с дикой формой Solanum habrochaites, может быть рекомендован для включения в селекционные программы по созданию устойчивых к фитоплазме сортов томата.

Заключение

Молекулярная диагностика распространения столбура на томатном поле позволила обнаружить, что степень заражения изученных генотипов ʹСа. P. solani' различалась на протяжении периода вегетации. Наиболее существенные различия по зараженности сортов были отмечены в августе, в период массового созревания плодов.

Проведенные исследования позволили выявить генотипы, которые были более восприимчивы и более устойчивы к заражению ʹСа. P. solani' в 2018 и 2019 годах. Прежде всего, было показано, что Cerasus проявил самую большую устойчивость к заражению ʹCa. P. solaniʹ среди исследованных сортов, сравнительно более высокий уровень поражения растений этого сорта столбуром был отмечен только в конце периода вегетации, в сентябре, при этом зараженными оказались чуть более половины растений. Надо отметить, что эти результаты хорошо согласуются с данными, полученными при анализе растений сорта Cerasus в предыдущие годы. Таким образом, сорт Cerasus может быть рекомендован селекционерам в качестве генетического материала при создании устойчивых к фитоплазме генотипов (гибридов, сортов). Кроме того, использование этого более устойчивого к фитоплазме сорта непосредственно в сельскохозяйственном производстве может быть экономически выгодно для аграриев за счет увеличение качества и количества собранных плодов.

Сорта Elvira и Desteptarea имели сходные показатели уровня зараженности растений фитоплазмой в течение двух лет исследований. Эти сорта проявили гораздо большую чувствительность к фитоплазменной инфекции по сравнению с сортом Cerasus, особенно заметной была разница в уровне распространения инфекции в период массового созревания плодов. Можно сделать вывод, что степень устойчивости сортов Elvira и Desteptarea к ʹCa. P. solaniʹ ниже, чем сорта Cerasus и, особенно, дикой формы томата Solanum habrochaites .

Единственным генотипом, чувствительность которого к инфекции ʹCa. P. solaniʹ сильно зависела от климатических условий сезона вегетации, оказался сорт Mary Gratefully. Было обнаружено, что в неблагоприятных климатических условиях лета 2019 года он был наиболее чувствительным к фитоплазме, степень его заражения была значительно выше по сравнению с другими сортами, причем это отмечалось уже в августе, на стадии массового созревания плодов. Напротив, в августе 2018 года этот сорт оказался менее подвержен поражению столбуром, меньшее число зараженных растений было зарегистрировано в этот период только у наиболее устойчивого к фитоплазме сорта Cerasus.

Растения дикой формы томата Solanum habrochaites оказались полностью невосприимчивы к фитоплазме, молекулярная диагностика не выявила ни одного зараженного ʹСа. P. solani' растения данного генотипа на протяжении всего периода вегетации. Данная форма может быть рекомендована для селекционеров как генетический материал для создания более устойчивых к фитоплазме гибридов или сортов томата, а также в качестве контрольного варианта при оценке чувствительности созданных или уже имеющихся сортов.

Резюмируя вышесказанное, можно сделать вывод, что молекулярная диагностика является полезным инструментом в процессе селекции сортов или гибридов томата, устойчивых к заражению фитоплазмой.

Об авторах:

Aighiuni Gh. Bahsiev – Junior Researcher Dep. Molecular Genetics,

Irina A. Zamorzaeva – Doc. Sci. (Biology), Leading Researcher,

Dep. molecular genetics

Nadejda I. Mikhnya – Doc. Sci. (Biology),

Leading Researcher, Dep. applied genetics