Молекулярно-генетическая характеристика факторов патогенности представителей рода Acinetobacter, выделенных из клинического материала и смывов с поверхностей объектов в медицинских организациях г. Ростова-на-Дону

В последнее время представители рода Acinetobacter , а именно A. baumannii , являются одними из нозокомиальных патогенов, распространенных в медицинских организациях по всему миру [Wong et al., 2017; Лавриненко, 2019].

Патогенные виды ацинетобактеров обычно являются этиологическим агентом инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), и могут вызывать аспирационную пневмонию, катетер-ассоциированную бактериемию, а также инфекции мягких тканей и мочевыводящих путей. Согласно данным литературы, летальность среди пациентов с внутрибольничной пневмонией составляет 35% [Шмакова, 2019]. Представители рода Acinetobacter относятся к шести опасным бактериям, входящих в группу ESКAPE, связанных с ИСМП и включающих Enterococcus faecium , Staphylococcus aureus , Klebsiella pneumoniae , Acinetobacter baumannii , Pseudomonas aeruginosa , Enterobacter spp. [Чеботарь и др., 2014].

Известно, что бактерии A. baumannii по своей природе обладают более высокой степенью патогенности для человека по сравнению с другими видами Acinetobacter , включая A. calcoaceticus , A. lwoffii , A. junii , A. baylyi и A. haemolyticus [Wong et al., 2017]. Сведения о факторах патогенности A. baumannii постоянно пополняются благодаря совершенствованию молекулярно-генетических исследований, в частности высокопроизводительного секвенирования [Лавриненко, 2019].

Факторы патогенности, вызывающие повреждение тканей и способствующие выживанию представителей Acinetobacter в организме человека, играют активную роль на всех стадиях инфекционного процесса, включая адгезию, инвазию (направленную на разрушение тканевых барьеров – клеток и межклеточного вещества), диссеминацию и персистенцию. Они также вызывают интоксикацию и способствуют уклонению от иммунного ответа [Чеботарь и др., 2014]. Факторы патогенности Acinetobacter контролируются генами, позволяющими адаптироваться возбудителю в особо сложных условиях (например, при воздействии антибиотических и дезинфицирующих средств). В таблице 1 представлена информация об основных генах, обеспечивающих патогенность и персистенцию ацинетобактеров.

Известно множество факторов патогенности A. baumannii, к которым относят механизмы адгезии, усвоение железа, активность полисахаридных мембранных и белковых фосфолипаз внешней мембраны, модификацию в пенициллинсвязывающих белках и везикулах внешней мембраны (OMV) [Лавриненко, 2019; Wong et al., 2017]. Известно, что белки, ассоциированные с поверхностной мембраной, вносят вклад в адгезивный процесс в тканевых структурах человека. По крайней мере три из них (OmpA, TonB-зависимый рецептор и Omp с молекулярной массой 34 КДа) обеспечивают закрепление возбудителя на фибронектине [Чеботарь и др., 2014]. Белок внешней мембраны A (OmpA), консервативный белковый домен, обнаруживаемый у многих грамотрицательных бактерий, как предполагается, обеспечивает адгезию к эпителиальным клеткам хозяина и необходим для формирования биопленки и устойчивости к комплементу [Лавриненко, 2019; Krishnan et al., 2012; Wong et al., 2017]. К важным факторам патогенности представителей Acinetobacter относят белок, кодируемый геном tonB-зависимого рецептора, входящего в состав наружной мембраны бактериальной клетки, который отвечает за усвоение железа и необходим для выживания бактерий в крови и легких [Скурихина и др., 2016].

Таблица 1

Гены, кодирующие факторы патогенности и персистенции, и их роль в патогенезе

[Genes encoding pathogenicity and persistence factors and their role in pathogenesis]

Гены, кодирующие факторы патогенности	Роль в патогенезе	Продукт гена
Патогенность
ompA	Адгезия к эпителиальным клеткам хозяина, биопленкообразование, устойчивость к комплементу [Лавриненко, 2019; Wong et al., 2017]	Белок OmpA опосредует образование бактериальной биопленки, заражение эукариотических клеток, устойчивость к антибиотикам и иммуномодуляцию [Nie et al., 2020]
omp33-36	Способствует адгезии, инвазии и цитотоксичности, обеспечивая выживание в различных органах и прогрессирование инфекции внутри хозяина [Novović et al., 2018]	Белок Omp33-36 участвует в развитии цитотоксичности (вызывает апоптоз и процессы аутофагии) в клетках, включая клетки иммунной системы и соединительной ткани [Rumbo et al., 2014]
fhaB	Участвует в адгезии, уничтожении клеток хозяина [Lee et al., 2017]	Белок FhaB – прикрепление бактерий к альвеолярным эпителиальным клеткам [Pérez et al., 2017]
rtx	Ген гемолизина – токсина [Зуева и др., 2013]. Участвует на начальной стадии адсорбции на поверхности клетки-хозяина [Wiles et al., 2013]	Ко-регулируемый гемолизином белок Hcp является структурным и эффекторным компонентом T6SS и маркером активированной T6SS [Зуева и др., 2013]
ata	Регулирует механизм транспорта факторов патогенности в клетку-хозяина [Лавриненко, 2019]	Адгезин Ата, важный фактор патогенности у многих грамотрицательных видов [Weidensdorfer et al., 2019]
tonB	Отвечает за усвоение железа [Скурихина и др., 2016]	Белок - TonB-зависимый рецептор, связан с захватом и транспортом крупных субстратов, таких как комплексы сидерофоров железа и витамина B12 [Чеботарь и др., 2014]
type II secretion system	Участвует в экспорте эффекторных белков, определяет колонизацию легких и распространение в другие органы [Лавриненко, 2019]	Секреторные белки (GSP); белки могут транспортироваться через мембрану для сборки в придатках на поверхности клетки или для высвобождения во внеклеточную среду [Filloux, 2004]
type VI secretion system (редкий)	Необходим при бактериальной конкуренции при полимикробной этиологии инфекционного процесса [Лавриненко, 2019]	13 основных белков необходимых для биогенеза и функционирования T6SS (Hcp, VipA и др.) [Filloux, 2004]
tuf	Способствует распространению и уклонению от системы комплемента [Koenigs et al., 2015]	Tuf действует как многофункциональный белок, который может способствовать патогенности, распространению и уклонению от системы комплемента [Koenigs et al., 2015]
Персистенция
per (редкий)	Участвует в образовании биопленки и адгезии [Zeighami et al., 2019]	Наличие белка PER улучшает способность клеток к адгезии, но это не всегда способствует образованию биопленок [Mohamed et al., 2023]
pilli	Участвует в процессе адгезии и образования биопленки [Lee et al., 2017]	Белок пилин используется для обмена генетическим материалом или в качестве механизма клеточной адгезии [Wörmann et al., 2014]
znuB	Участвует в повышении выживаемости и персистенции [Lee et al., 2017]	ZnuB - интегральный мембранный белок, который транспортирует цинк через цитоплазматическую мембрану [Li, Jogl, 2007]
zigA	Участвует в повышении выживаемости и персистенции [Lee et al., 2017]	HutH функционирует преимущественно как во время цинкового голодания, так и в условиях избытка цинка для мобилизации лабильного пула His-Zn [Nairn et al., 2016]

Окончание табл. 1

Гены, кодирующие факторы патогенности	Роль в патогенезе	Продукт гена
csuA	Отвечает за процесс биопленкообразо-вания [Садеева и др., 2023]	CsuA рекомбинантный белок, необходимый для формирования биопленки на абиотических поверхностях, но не требуется для прикрепления к эпителиальным клеткам [Ramezanalizadeh et al., 2020]
bfmS/bfmR	Участвует в формировании биопленок на абиотических поверхностях, устойчивость к антибиотикам, выживаемость в стрессовых условиях [Лавриненко, 2019]	BFMRS - сенсорная киназа регулирует структуры клеточной оболочки, важные для вирулентности и устойчивости к противомик-робным препаратам [Kim et al., 2019]
recA	Модулирует развитие биопленки [Ching et al., 2023]	Белок RecA, осуществляет рекомбинационный процесс в ходе нормального клеточного роста [Wipperman, 2018]
surA1	Играет роль в выживаемости в организме человека, в поддержании целостности мембраны и сывороточной резистентности [Lee et al., 2017]	Пептидилпролилизомераза (PPIase) SurA является основным фактором в биогенезе белков внешней мембраны OMP и как таковые играют важную роль в гомеостазе клеточной оболочки [Behrens-Kneip, 2010]
uspA	Участвует в поддержании выживаемости и уничтожении клеток хозяина [Lee et al., 2017]	Белок UspA, участвует в реакции на окислительный стресс, вызванной Н 2 О 2 , и низким уровнем рН [Elhosseiny et al., 2015]
adeR/adeS	Регулирует экспрессию генов эффлюк-сной помпы в ответ на раздражители окружающей среды [El Edel et al., 2017]. Отвечает за устойчивость к антибиотическим препаратам [Wen et al., 2017]	AdeR является регулятором системы оттока AdeABC. Инактивация AdeR приводит к чувствительности к аминогликозидным антибиотикам [Wen et al., 2017]
baeS	Участвует в реакции на стресс, усилении экспрессии эффлюксного насоса в ответ на специфические агенты, повреждающие оболочку [Lee et al., 2017]	BaeS - сенсорная киназа в системе регуляции BaeSR. Участвует в регуляции адаптации к окружающей среде и передаче сигналов, включая стрессовые условия [Lin et al., 2014]

Не менее важным фактором является способность бактерий колонизировать и образовывать биопленку на биотических и абиотических поверхностях. К таким факторам, способствующим биопленкообразо-ванию, относят белок, ассоциированный с биопленкой (Bap), систему шаперон-ашерной сборки пилей (Csu), внеклеточный экзополисахарид (EPS), двухкомпонентную систему (BFMs/BfmR). Показано [Мар-тюшева и др., 2023], что образование биопленки и прикрепление бактерий A. baumannii к эпителиальным клеткам респираторного тракта усиливается в присутствии и экспрессии гена per [Zeighami et al., 2019]. Формирование биопленок в очаге воспаления ведет к хроническому инфекционному процессу и сопровождается неудовлетворительными результатами проведенной антибиотикотерапии [Гостев и др., 2010]. Микроорганизмы, формирующие биопленки, приобретают устойчивость к дезинфицирующим средствам. Считается, что 60-65% инфекций, ассоциированных с ИСМП, связаны со способностью возбудителей существовать в форме биопленок.

Известно, что представители Acinetobacter могут сохранять жизнеспособность в течение длительного периода времени и обладают множеством механизмов выживания, что повышает способность ацинето-бактеров к распространению [Лавриненко, 2019].

Немаловажным фактором адгезии патогенов на абиотическом материале является наличие у бактериальных клеток пилей, которые также способствуют формированию биопленки [Чеботарь и др., 2014; Tomaras et al., 2003]. При этом данная система не играет роли при биопленкообразовании на поверхности эпителиальных клеток человека [de Breij et al., 2009]. Патогенность ацинетобактеров является сложным феноменом, который может быть связан с различными вариациями обнаруженных генов.

Цель настоящего исследования – выявление генов, кодирующих факторы патогенности у штаммов A. baumannii , A. calcoaceticus и A. junii , выделенных из клинического материала и смывов с поверхностей объектов в медицинских организациях (МО) г. Ростова-на-Дону.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования являлись штаммы ацинетобактеров – A. baumannii (34 штамма), A. calcoaceticus (2 штамма) и A. junii (1 штамм), выделенные из образцов мокроты, полученных от пациентов с ВП, находившихся на лечении в МО г. Ростова-на-Дону, а также смывов с объектов окружающей среды МО. Культивирование бактерий проводили в соответствии с МУК 3.1.2/4.2.3373-23 «Эпидемиоло- гический надзор за внебольничными пневмониями». Для определения видовой принадлежности представителей рода Acinetobacter использовали метод времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF) с программным обеспечением MALDI Biotyper v.3.0. (Bruker Daltonics, Германия). В качестве критерия видовой идентификации были использованы рекомендуемые значения «Score» ≥2,3.

Полногеномное секвенирование штаммов проводили на платформе «Illumina MiSeq» c использованием набора «Nextera DNA Library Preparation Kit». Поиск факторов патогенности A. baumannii, A. calcoaceticus и A. junii осуществляли при помощи программы «Fragment Extractor» . В качестве базы данных нуклеотидных последовательностей использовали базу данных NCBI .

Результаты и их обсуждение

В результате исследования образцов мокроты, проведенного за период с 2020 по 2023 г., было изолировано 37 штаммов представителей рода Acinetobacter [Попова и др., 2021; Павлович и др., 2023]. В ходе исследования из клинического материала (мокрота) выделены и идентифицированы A. baumannii – 29 штаммов, A. calcoaceticus – 2 штамма, A. junnii – 1 штамм, а также из смывов с объектов МО - 5 штаммов A. baumannii. В результате анализа данных полногеномного секвенирования был обнаружен набор генов, кодирующих факторы патогенности и персистенции (табл. 2).

Таблица 2

Гены, кодирующие факторы патогенности и персистенции, обнаруженные у представителей рода Acinetobacter

[Genes encoding pathogenicity and persistence factors found in representatives of genus Acinetobacter ]

Гены, кодирующие факторы патогенности	Штаммы, изолированные из смывов (абс.)	Штаммы, изолированные из клинического материала (абс.)
	A. baumannii (n=5)	A. baumannii (n=29)	A. calcoaceticus (n=2)	A. junnii (n=1)

Патогенность

ompA	5	26 (89.6%)	2	0
omp33-36	5	18 (62.1%)	2	0
fhaB	1	6 (20.6%)	1	0
rtx	2	16 (55.1%)	2	0
ata	5	17 (58.6%)	1	0
tonB	5	26 (89.6%)	2	0
type II secretion system	3	21 (72.4%)	2	0
type VI secretion system (редкий)	0	9 (31.0%)	1	0
tuf	5	26 (89.6%)	2	1

Персистенция

per (редкий)	0	13 (44.8%)	0	0
pilli	5	27 (93.1%)	2	0
znuB	5	20 (68.9%)	2	0
zigA	5	26 (89.6%)	2	0
csuA	2	13 (44.8%)	2	0
bfmS/bfmR	2	18 (62.1%)	2	0
recA	5	26 (89.6%)	2	0
surA1	4	22 (75.8%)	2	0
uspA	5	20 (68.9%)	2	0
adeR/adeS	5	19 (65.5%)	1	0
baeS	5	22 (75.8%)	2

Гены патогенности ompA, omp33-36, pilli, tonB, type II secretion system, type VI secretion system, rtx были выявлены у подавляющего большинства штаммов, полученных из клинических изолятов. Аналогиченые гены с высокой частотой были обнаружены в штаммах, полученных из смывов с объектов МО. Гены fhab и type VI secretion system являются редкими и выделяются среди 20-30% клинических штаммов. У всех штаммов обнаружена группа генов, которые отвечают как за факторы патогенности, так и факторы персистенции – ompA, omp33-36, pilli, tuf, uspA, znuB, zigA, recA, adeR/adeS, ata, baeS и tonB. Другая часть генов была представлена в меньшей степени – csuA/B, bfmS/bfmR, surA1, fhaB. Немаловажным является наличие генов, ассоциированных с возможностью колонизировать легкие и распространяться в другие органы, выявленные у трех штаммов, изолированных из смывов (type II secretion system). Как и другие грамотрицательные патогены, A. baumannii также имеет в своем составе гены, ответственные за секрецию белков, необходимые для более легкой адапта- ции - type II secretion system у большинства штаммов. Наличие генов (type VI secretion system), необходимых для выживания и бактериальной конкуренции, обнаружено у некоторых штаммов, относящихся только к клиническим. Данные гены являются редко встречающимися.

Помимо генов факторов патогенности выявлен обширный спектр детерминант, обеспечивающих персистенцию и выживаемость микроорганизмов. Наибольшая часть представлена генами - pili, znuB, zigA, bfmS/bfmR , recA , surAl , uspA , adeR/adeS , baeS.

Способность образовывать биопленки важна для жизнедеятельности и обеспечивает микроорганизмам защиту от внешнего мира, создавая барьер от проникновения антимикробных средств и других веществ, что позволяет сопротивляться иммунному ответу хозяина. Данные процессы возможны благодаря наличию определенных генов, выявленных у большинства штаммов. К таким генам относятся ompA , csuA/В , surA1 , bfmS/bfmR , pilli , recA. Однако в одной из МО среди изученных штаммов гены, ассоциированные с повышенной выживаемостью и персистенцией ( znuB ) и адгезией ( fhaB и omp33-36 ), обнаружены не были.

Приспособление к постоянно меняющимся условиям среды обитания - одно из важнейших свойств микроорганизмов, и обусловлено наличием гена surA1, обнаруженного у множества изученных штаммов. Более половины штаммов, изолированных из клинического материала, обладали генами baeS , adeR/adeS , способствующими выживанию в условиях стресса и возможном повреждении оболочки клетки.

Немаловажным в ходе инфекционного процесса является способность микроорганизмов «ускользать» от иммунитета хозяина (системы комплемента), что может быть связано с наличием гена tuf , обнаруженного у большей части изученных штаммов. Также были выявлены гены uspA и zigA , способствующие повышению степени выживаемости микроорганизма в организме хозяина. Около половины клинических штаммов A. baumannii обладали генами ata , регулирующими механизмы транспорта факторов патогенности в клетку хозяина. Почти у всех секвенированных штаммов A. baumannii были определены гены tonB , функциональная роль которых заключается в способности выживать в условиях дефицита железа.

Между тем, ген per , отвечающий за образование и адгезию, отсутствовал у штаммов, изолированных из смывов в одной МО, тогда как в других организациях он обнаруживался у большей части штаммов. В образцах, полученных из МО, был изолирован один штамм A. junii . При исследовании генов факторов патогенности в данном штамме был выявлен ген tuf , способствующий распространению микроорганизма и уклонению от системы комплемента. Кроме того, было выделено два штамма A. calcoaceticus , обладающих множеством генов факторов патогенности. Оба штамма обладали генами, кодирующими факторы адгезии, биопленкообразования, обеспечивающие выживание - ompA , omp33-36 , csuA , bfmS/bfmR , surA1 , pili , uspA , znuB , zigA , recA , baeS , способствующими распространению и уклонению от системы комплемента tuf . Также выявлен ген tonB , который отвечает за усвоение железа, необходимого для выживания микроорганизмов. Кроме того, данные штаммы содержали гены, кодирующие type II secretion system , определяющие колонизацию легких и распространение в другие органы. У одного штамма A. calcoaceti-cus выявлены гены, кодирующие type VI secretion system, необходимые для функционирования системы секреции шестого типа. Кроме того, у одного штамма обнаружены гены, регулирующие механизмы транспорта факторов патогенности adeR/adeS , ata, ген, способствующий адгезии, и гены, участвующие в уничтожении клеток хозяина fhaB.

Экспрессия подобных генов может регулироваться как внешними условиями микроорганизма и плотностью популяции, так и особенностями функций макроорганизма.

Заключение

Наибольшая частота и широкий спектр генов, кодирующих факторы адгезии, биопленкообразования, отвечающие за приспособление и выживание к факторам окружающей среды, отмечены у штаммов, изолированных из клинического материала пациентов. Все штаммы, выделенные из смывов с объектов окружающей среды МО, обладали широким спектром генов, кодирующих факторы патогенности. Наличие данных генов может предопределять выраженные адгезивные и персистентные свойства, устойчивость к воздействию внешних факторов, антибактериальных препаратов и дезинфицирующих средств. Не менее важным является этап инвазии, за возможность которого ответственны гены, обнаруженные у исследованных штаммов. Детерминанты патогенности обнаружены у штаммов, изолированных из смывов с поверхности объектов МО стационара, что свидетельствует о циркуляции внутри отделения МО патогенных штаммов Acinetobacter . Штаммы, выделенные из образцов, полученных из различных медицинских учреждений, обладали широким спектром генов патогенности и персистенции. Необходимо их дальнейшее изучение для определения генетических линий, а также выявления причин выживаемости микроорганизмов на поверхностях объектов в МО. С учетом выявленных генов биопленкообразования необходимо также изучение штаммов, устойчивых к дезинфицирующим средствам, и определение спектра их антибиотикорезистентности. Данные свойства микроорганизмов способствуют распространению возбудителя в стационаре МО и определяют возможности для развития ИСМП.