Молекулярно-генетическая интеграция нейрогенеза, нейроапоптоза и пространственной памяти у взрослых крыс



МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНТЕГРАЦИЯ НЕЙРОГЕНЕЗА, НЕЙРОАПОПТОЗА И ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ПАМЯТИ У ВЗРОСЛЫХ КРЫС

М.А. Грудень, А.М. Ратмиров, З.И. Сторожева, О.А. Соловьева, А.Г. Шабынина, В.В. Шерстнев

НИИ НФ им. П.К. Анохина, г. Москва, Россия

Проблема молекулярно - генетических механизмов обучения и памяти - актуальная проблема в нейробиологии. Многообразие интегративных молекулярных процессов, участвующих в процессах обучения и долговременной памяти, значительно усложняет исследования, проводимые в этой области. В настоящее время появились новые экспериментальные подходы к изучению взаимосвязей между транскрипционным статусом генов и специфическими функциями мозга [3]. Один из перспективных подходов основан на положении о том, что в основе функционирования мозга лежат сопряженные процессы неонейрогенеза и нейроапоптоза, постоянно протекающие в нервной системе человека и животных, а также молекулярные факторы, обеспечивающие интеграцию данных механизмов [2]. Ранее нами была описана взаимосвязь региональных церебральных процессов нейрогенеза и апоптоза на молекулярно-генетическим уровне при изучении экспрессии генов Ascll, Bax, Bcl2, Casp3, Casp8, Casp9, Dffb, MyhlO, Naip2, Napa, Notch2, Numb, Pura, S100a6 и Tnf, белковые продукты которых вовлечены в обеспечение процессов нейрогенеза и нейроапоптоза в различных отделах головного мозга взрослых интактных крыс [1]. Необходимо отметить, что дальнейшее выяснение молекулярно-генетических механизмов структурно - функционального взаимодействия неонейрогенеза и нейроапоптоза в условиях формирования и обеспечения процессов пространственной памяти явилось целью настоящей работы. Исследование проведено с использованнем пространственного водного лабиринта на половозрелых крысах-самцах Wistar весом 220 г (n=27), разделенных на 3 экспериментальные группы: группа 1 - интактные крысы (n=9), группа 2 - группа активного контроля (n=9), группа 3 - обученные в водном лабиринте Морриса крысы (n=9) при соблюдении этических норм работы с экспериментальными животными, сформулированных Советом Европейского сообщества об использовании животных для экспериментальных исследований (Директива 86/609/EEC в пересмотре от 14.11.2005). Экспериментальный протокол составлен таким образом, что время плавания в контрольной группе соответствовало времени, проведенному в воде обучавшимся животным, т.е. каждому обучавшемуся животному по времени и паттерну плавания соответствовала одна “контрольная” особь.

По окончании поведенческих экспериментов животных декапитировали и извлекали на холоду (+4ºС) образцы гиппокампа, мозжечка и префронтальной коры мозга и ПЦР в режиме реального времени по протоколу, используя в качестве референсного гена для последующего расчёта относительно уровня экспрессии изучаемых генов по методу 2-ΔΔCt ген β-актина [5]. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ “Statistica 7.0” (“StatSoft”, США). В ходе проведенных поведенческих экспериментов по формированию долговременной пространственной памяти показано, что среднее значение времени достижения платформы у половозрелых крыс Wistar во втором и всех последующих сеансах было достоверно ниже, чем в первом (р<0.01–0.05), а к концу 4-го сеанса обучения значения времени достижения платформы были меньше 10 с, что свидетельствует о формировании стабильной долговременной пространственной памяти. При проведении молекулярно-генетических экспериментов обнаружено, что экспрессия гена каспазы-3 значительно увеличена в гиппокампе и префронтальной коре у крыс Wistar как в группе активного контроля, так и обучения пространственному навыку (по сравнению с группой интактных крыс). Так, в гиппокампе у животных в группе активного контроля экспрессия Casp3 увеличена в 21,7 раза и существенно меньше – в группе обучения (в 3,4 раза). В мозжечке крыс обеих групп достоверных различий по сравнению с интактными животными не документировано. В префронтальной коре выявлена сходная с гиппокампом картина изменений экспрессии гена Casp3: в группе активного контроля увеличение относительного количества мРНК каспазы-3 составило 28.8 раза, а в группе обучения только 3 раза (при сравнении с интактным контролем. Изменения экспрессии гена Ascl1 были сходны в гиппокампе и мозжечке в обеих группах экспериментальных животных. В гиппокампе увеличение экспрессии гена Ascl1 составило 5,2 раза и 9,9 раз в группе активного контроля и группе обучения, соответственно. В мозжечке увеличение экспрессии гена Ascl1 составило только в группе обучения в 5 раз, а у активного контроля отличий выявлено не было (по сравнению с интактным контролем). В префронтальной коре в группе активного контроля увеличена экспрессия Ascl1 в 7,2 раза, а при формировании пространственной памяти – в 5 раз (по отношению к интактным животным. Паттерн экспрессии гена S100a6 имеет схожую картину во всех исследованных структурах мозга: в группе обучения количество мРНК данного кальций-связывающего белка больше, чем в группе активного контроля. Так, экспрессия гена S100a6 у обученных крыс по сравнению с активным контролем достоверно повышена в мозжечке – в 5 раз и в префронтальной коре – в 1,6 раз (в гиппокампе увеличение в 1,9 раза не достоверно, т.к. p=0,29). В работе выявлены региональные особенности экспрессии генов Casp3, Ascl1 и S100a6. При обучении, по сравнению с активным контролем, наблюдается большее количество достоверных корреляций между уровнями экспрессии изучаемых генов. В группе обучения достоверные корреляции имеют место во всех исследованных структурах: в гиппокампе и префронтальной коре – Casp3/Ascl1, в мозжечке – S100a6/Ascl1. В группе активного контроля установлена внутриструк-турная взаимосвязь только в гиппокампе – Casp3/S100a6 в гиппокампе. Стоит отметить, что документированы и межструктурные корреляции, различающиеся между группами крыс: у обученных животных выявлена взаимосвязь между экспрессией гена Casp3 в мозжечке и префронтальной коре, а у активного контроля – взаимосвязи между экспрессией гена S100a6 в префронтальной коре как с экспрессией гена Casp3 в мозжечке, так и с экспрессией гена Ascl1 в гиппокампе.

Предположено, что выявленный профиль экспрессии генов Casp3 , Ascl1 и S100a6 в структурах мозга взрослых крыс отражает структурно - функциональные особенности вовлеченности генетического аппарата в сопряженной регуляции нейрогенеза и нейроапоптоза, участвующих в специфическом обеспечении процессов обучения и памяти [4], в частности, пространственной памяти у взрослых животных.