Молекулярно-генетическая оценка риска детерминированности повышенной активности ангиотензинпревращающего ферментапри геморрагической лихорадке с почечным синдромом

Методы. В исследование включили 409 больных с серологически подтвержденным методом непрямых флюоресцирующих антител диагнозом ГЛПС (346 мужчин и 63 женщин) в возрасте от 15 до 65 лет (средний возраст 33,6±3,5 лет), находившихся на стационарном лечении в МУ «Инфекционная клиническая больница № 4» г. Уфы и в отделении гемодиализа Республиканской клинической больницы им. Г.Г. Куватова в 2003-2008 годах. Критериями исключения из групп исследования были наличие в анамнезе гипертонической болезни, болезней сердца и сосудов, сахарного диабета, ревматизма, злокачественных заболеваний, заболеваний печени и почек. При определении степени тяжести ГЛПС использовали классификацию Б.З. Сиротина [9]. Среднетяжелая форма выявлена у 252 больных (61,6%), тяжелая без осложнений – у 109 больных (26,7%), тяжелая с осложненным течением – у 48 больного (11,7%). Группу контроля составили 52 практически здоровых лица, сопоставимых по полу и возрасту.

Для определения активности АПФ взятие крови объемом 5 мл производили путем венепункции локтевой вены утром натощак. Собранную в специальные пробирки без антикоагулянтов кровь выдерживали 2 часа при температуре 18°С, после чего центрифугировали при температуре 4°С и 1000g и собирали сыворотку. Образцы сыворотки крови для анализа хранили при температуре -20°С не более 6 месяцев. Активность АПФ в сыворотке крови определяли кинетическим ме тодом с использованием набора фирмы «Вьhlmann»

450097 г. Республика Башкортостан, г. Уфа, бульвар Х. Давлетшиной, д.18., кв. 101.

Тел. 89173484738;

(Швейцария). Абсорбцию света регистрировали с помощью ИФА-ридера «Вench mark» компании «Вio-Rad». Для генетического исследования пробы венозной крови брали в пробирки типа вакутейнера с ЭДТА. ДНК выделяли из периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции [ 10 ] . Анализ полиморфизма A1166С гена AGTR1 проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с последующим ферментативным гидролизом с использованием эндонуклеазы рестрикции BstDEI « Сибэнзим». Результаты амплификации оценивали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с последующим окрашиванием бромидом этидия и визуализацией в проходящем ультрафиолетовом свете. В результате амплификации участка гена AGTR1 , содержащего нуклеотидную замену А1166С, получали ампликон длиной 225 п.о. Ампликон, содержащий аллель * С1166 , несет сайт узнавания фермента рестрикции BstDEI , и, расщепляясь, образует продукты размером 110 и 115 п.о., в то время как фрагмент ДНК, содержащий аллель * А1166 , остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 225 п.о. после обработки BstDEI соответствует генотипу * А1166 /* А1166 , двух фрагментов (110 и 115 п.о.) – генотипу * С1166 /* С1166 и трех (110, 115 и 225 п.о.) – гетерозиготному генотипу * А1166 /* С1166 .

Обработку результатов исследования проводили с использованием стандартного статистического пакета программ Statistica 7.0 for Windows и SPSS 13. Результаты исследования активности АПФ оценивали методами непараметрической статистики: определяли медиану (Ме), интерквартильный интервал [25% и 75%], достоверность межгрупповых различий средних величин оценивали при помощи критерия Манна-Уитни. Результаты исследования представляли как Ме [Ԛ1; Ԛ3]. При сравнении частот генотипов, аллелей в группах больных ГЛПС с различной степенью тяжести заболевания использовали критерий2 (хи-квадрат) Пирсона. Для всех видов анализа различия принимали за значимые при р<0,05.

Результаты. Определение активности АПФ в сыворотке крови больных ГЛПС показало, что она в равной степени зависит и от периода заболевания, и от степени его тяжести (табл. 1). Лихорадочный период заболевания при среднетяжелой форме характеризуется статистически незначимой тенденцией к снижению активности АПФ, в остальные периоды данной формы наблюдается статистически значимый рост активности фермента с пиком в период полиурии – в 3,1 раза выше значений для контроля (рис. 1). Аналогичная тенденция к изменению изучаемого показателя имеет место и при тяжелой форме болезни без осложнений. Однако, несмотря на динамику, сходную со среднетяжелой формой, активность фермента в полиурический период и в период восстановленного диуреза неосложненной формы ГЛПС достигает более высоких значений (в 3,5 раз выше контрольных значений) вплоть до статистически значимых различий в последний период не только с группой контроля, но и между данными группами больных при восстановлении диуреза. Осложненная форма ГЛПС имеет отличную от остальных форм болезни динамику изменения активности АПФ: гиперактивность энзима без значительных колебаний от периода к периоду регистрируется в течение всей болезни также с максимумом в полиурический период – в 3,3 раза выше контрольных значений – и со статистически незначимой тенденцией к снижению в период восстановленного диуреза. При присоединении осложнений статистически значимыми становятся не только раз- личия с контролем, но различия со среднетяжелой и неосложненной формами болезни. Нормализации изучаемого показателя к периоду восстановленного диуреза при всех формах тяжести ГЛПС на фоне базисной терапии не происходит.

Тип полиморфизма, последовательность праймеров и номенклатура аллелей анализируемых полиморфных локусов гена ген рецептора (тип 1) ангиотензина II ( AGTR1 ) представлены в таблице 2. Результаты оценки распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса А1166С гена AGTR1 у больных ГЛПС в зависимости от степени тяжести заболевания представлены в таблице 3. Во всех изученных выборках распределение частот генотипов соответствовало распределению Харди-Вайнберга. Сравнительный анализ распределения частот генотипов полиморфного локуса A1166C гена AGTR1 не выявил статистически значимые различия между группами больных с различной степенью тяжести

Рис. 1. Активность АПФ в сыворотке крови больных ГЛПС в зависимости от тяжести заболевания (% к контролю); * – статистическая значимость различий с контролем

Таблица 1

Активность АПФ в сыворотке крови больных ГЛПС различной степени тяжести на фоне базисной лекарственной терапии (мкмоль/л х мин)

Период заболевания	Форма заболевания
	среднетяжелая	тяжелая без осложнений	тяжелая с осложнениями
лихорадочный	12,4 [8,8; 18,2] р>0,07	9,7 [1,1; 14,1] р>0,06; р1>0,9	49,0 [42,4; 50,3] р<0,002; р2<0,006; р3<0,006
олиго-	36,2 [28,2;54,7]	28,2 [21,2; 47,7]	50,8 [45,9; 63,5]
анурический	р<0,006	р<0,019; р1>0,38	р<0,003; р2<0,03; р3<0,009
полиурический	55,0 [35,3; 71,5] р<0,0006	60,9 [50,6; 77,6] р<0,0002; р1>0,2	59,2 [45,9; 70,6] р<0,0001; р2>0,4; р3>0,5
восстановленного диуреза контроль 18,05 [15,0; 21,5]	38,0 [34,4; 45,9] р<0,0001	56,5 [44,1; 59,0] р<0,0004; р1<0,02	49,4 [42,4; 58,3] р<0,0001; р2<0,03; р3>0,14

Примечание: р – значимость различий с группой контроля; р1 – значимость различий между среднетяжелой формой и тяжелой формой без осложнений; р2 –значимость различий между среднетяжелой формой и тяжелой формой с осложнениями; р3 – значимость различий между тяжелой формой без осложнений и тяжелой формой с осложнениями.

Тип полиморфизма, последовательность праймеров и номенклатура аллелей анализируемых полиморфных локусов

Таблица 2

ген [OMIM], локализация	полиморфизм (аллели)	праймеры (фермент рестрикции)
АGTR1 [106165] 3q21-q25	А1166С *А1166 - 225 п.о. *С1166 - (110 п.о.+115 п.о.)	5' GСАССАTGTTTTGАGGTTGА 3' 5' TGTGGСTTTGСTTTGTСTTG 3' (ВstDEI )

Таблица 3

Распределение частот генотипов и аллелей полиморфного локуса A1166С генома AGTR1 у больных ГЛПС различной степени тяжести заболевания

форма заболевания		генотипы			аллели
		*А/*А	*А/*С	*С/*С	*А	*С
	n	84	65	6	233	77
среднетяжелая	pi±Sp, СI%	54,19±4,00	41,94±3,96	3,87±1,55	75,16±2,45	24,84±2,45
тяжелая без	n	54	30	6	138	42
осложнений	pi±Sp, СI%	60,00±5,16	33,33±4,97	6,67±2,63	76,67±3,15	23,33±3,15
тяжелая с	n	32	12	3	76	18
осложнениями	pi±Sp, СI%	68,09±6,80	25,53±6,36	6,38±3,57	80,85±4,06	19,15±4,06

Примечание: n – абсолютное число генотипов (аллелей); pi – частота; Sp – ошибка pi.;2 – хи квадрат; p – уровень значимости; df – число степеней свободы.

ГЛПС (p>0,05). Выявлено равнозначное распределение частот генотипа *C1166 / *C1166 в группах больных со средней и тяжелой формой UKGС (54% и 60% соответственно). Гетерозиготный генотип *A1166 / *C1166 встречался почти на 10% больше у больных с средней тяжестью (42%) по сравнению с тяжелой формой ГЛПС (33%). У больных более тяжелой формой ГЛПС отмечено почти в 2 раза увеличение частоты генотипа *C1166 / *C1166 (6,7%) по сравнению со средней степенью тяжести заболевания (3,9%) (рис. 2).

Обсуждение. Основная часть АПФ синтезируется в эндотелии сосудов и в норме. Около 90% фермента фиксирована на эндотелиальной мембране и только около 10% его активности приходится на плазму крови. Основным эффектором АПФ является АТ II, действие которого реализуется через специфические ангиотензиновые рецепторы. Наибольшее значение имеет рецептор АТ II 1 типа, через стимуляцию которого реализуется большинство как физиологических, так и патофизиологических эффектов данного пептида: вазоконстрикция, увеличение минутного объема сердца, стимуляция секреции альдостерона и подавление вазопрессина, повышение уровня ингибитора тканевого активатора плазминогена, стимуляция выработки цитокинов с инициацией воспалительного процесса в сосудистой стенке, стимуляция генерации активных форм кислорода и др. [11, 12]. При ГЛПС, вызываемом эндотелиотропным вирусом, имеет место как гиперактивация эндотелия, так и его повреждение [13, 14], что ведет, с одной стороны, к усиленной экспрессии ее клетками АПФ, а с другой – к протеолитическому отщеплению молекул фермента от поврежденных эндотелиоцитов и, как следствие, – к повышению пула плазменного АПФ. Нельзя исключить также усиленную экспрессию АПФ по принципу обратной связи вследствие отсутствия его прессорного эффекта в результате нарушения рецепции продукта катализируемой им реакции – АТ II. Нами выявлены значительные сдвиги в активности данного фермента зависимости от тяжести ГЛПС и наличия осложнений: среднетяжелая форма характеризуется наименее выраженной по сравнению с остальными формами болезни активностью фермента и отсутствием его «скачков» в динамике, при тяжелой форме заболевания без осложнений имеет место выраженный подъем активности к периоду развития полиурии, а при наличии осложнений гиперактивность АПФ наблюдается на всем протяжении заболевания со с статистически значимыми межгрупповыми различиями. Однако изучение полиморфизма гена рецептора АТ II 1 типа показало, что аллели *А1166 и *С1166, а также генотипы *А1166/*А1166, *А1166/*С1166 и *С1166/*С1166 не ассоциированы с со степенью тяжести течения ГЛПС, что позволяет сделать вывод о том, что высокая активность АПФ при ГЛПС, которая тем выраженнее, чем тяжелее течение болезни, не обусловлена нарушенной рецепцией АТ II из-за отсутствия васкулярного эффекта и может быть расценена как вполне адекватная реакция макроорганизма в ответ на метаболические изменения, первоначально обусловленные действием хантавируса – возбудителя ГЛПС.

Заключение .

• 1.    У больных ГЛПС выявлено статистически значимое повышение в крови активности АПФ, зависящее от периода и степени тяжести заболевания.

• 2.    Сравнительный анализ распределения частот генотипов полиморфного локуса A1166C гена ангиотензина II AGTR1 не выявил статистически значимые

• 3.    Повышение активности АПФ при ГЛПС, особенно выраженное при тяжелой форме, не носит адаптивный характер из-за дефектов в рецепции АТ II при ГЛПС и является адекватным метаболическим ответом организма в ответ на внедрение эндотелио-тропного вируса.

Рис. 2. Распределение частот генотипов и аллелей полиморфного локуса А1166С генома АGTR1 у больных ГЛПС в зависимости от тяжести заболевания (%)

различия между группами больных с различной степенью тяжести ГЛПС.