Молекулярно-генетические и сывороточные маркеры нарушений фолатного обмена у больных пролиферативными заболеваниями и раком молочной железы

В последние годы среди известных причин рака молочной железы (РМЖ) (генетические, эндокринные, иммунные, инфекционные) большое значение придается наследственным и приобретённым факторам, приводящим к нарушению метаболизма фолиевой кислоты. Ряд исследований [1, 2] показал, что РМЖ может являться следствием ферментопатии фолатного цикла, приводящей к дефициту метильных групп и к изменению концентрации гомоцистеина (ГЦ) и других аминотиолов в крови. Ключевой фермент фолатного цикла – MTHFR [MIM 236250] – переводит фолиевую кислоту в ее активную форму 5-метилтетрагидрофолат. Фермент MTRR [MIM 602568] участвует в восстановлении активности MTR [MIM 156570] – фермента, непосредственно осуществляющего метилирование гомоцистеина. Полиморфные варианты генов MTHFR, MTR и MTRR , обусловливая различную функциональную активность белковых продуктов, влияют на рост уровня ГЦ в крови [3].

Гомоцистеин может влиять на регуляцию активности многих генов, среди которых есть выполняющие провоспалительные и проапоптозные функции, а также на развитие ряда злокачественных опухолей [1, 2, 4, 5], а латентные нарушения обмена ГЦ встречаются почти у 50 % обследуемых с нормальным уровнем и чаще отмечаются у наиболее клинически тяжелых больных. Дисбаланс, вызванный метаболитами метионинового цикла, может повлиять на уровень метилирования ДНК в клетках, что определяется еще до появления их злокачественного фенотипа [4]. Таким образом, комплексное исследование генов фолатного обмена может повысить точность выработки прогностических критериев доброкачественных и злокачественных образований молочной железы [6, 7], а коррекция эпигенетических нарушений атипичных клеток является перспективным направлением борьбы со злокачественными новообразованиями.

Цель исследования – изучить ассоциацию носительства полиморфизма генов белков фолатного

цикла с развитием болезни, а также с уровнем гомоцистеина, цистеина и глутатиона в сыворотке крови у больных пролиферативными заболеваниями молочной железы в Забайкалье.

Материал и методы

В исследование вошли 35 больных с пролиферативными заболеваниями молочной железы (ПЗМЖ) – фиброаденомой, фиброзно-кистозной мастопатией – и 77 пациенток с РМЖ, в возрасте 46–66 лет. Диагноз подтвержден гистологически. Контрольную группу составили 144 здоровые женщины Забайкальского края в возрасте 31–50 лет, не имеющие на момент исследования онкологической патологии. Все участницы исследования подписывали информированное согласие. Протокол исследования № 69 одобрен ЛЭК при ФГБОУ ВО ЧГМА от 24 декабря 2014 г.

Определение в сыворотке крови цистеина (Cys), гомоцистеина, глутатиона (GSH) осуществляли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии [8]. Экстракцию ДНК из лейкоцитов цельной периферической крови проводили посредством комплекта реагентов «ДНК-Экспресс Кровь» (ООО НПФ «Литех», Россия), согласно инструкции производителя. Генотипирование проводилось с использованием набора «Генетика Метаболизма Фолатов» для выявления полиморфизма MTHFR(С677T), MTHFR(А1298C), MTR(A2756G), MTRR(A66G) (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва) методом полимеразной цепной реакции с детекцией продукта амплификации в режиме реального времени (амплификатор ДТ-96 (OOO «ДНК-Технология», Россия)).

Статистический анализ данных проведен с помощью Ms Excel 10.0, Statistica 6.0. Для оценки соответствия распределений наблюдаемых генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди – Вайнберга и для сравнения распределений частот генотипов и аллелей между исследуемыми группами использовали критерий χ2.

Для оценки аддитивного эффекта изучаемых аллелей нами была предложена модель генетического индекса с переводом носительства отдельных аллеломорфов в количественный признак, характеризующий увеличение рискового эффекта на фоне увеличения количества минорных аллелей: гомозиготам по «нормальному» (дикому) аллелю присваивали 1 балл, гетерозиготам – 2 балла, гомозиготам по минорному аллелю – 3 балла. Затем для каждого человека суммировали баллы всех исследованных генотипов и определяли среднюю величину (М). Проверка характера распределения значений в выборке проводилась с помощью теста Shapiro – Wilk's. Изучение статистических связей между показателями выборки проводили с помощью корреляционного анализа Спирмена (R). Статистическую значимость различий количественных признаков определяли по критерию

Манна – Уитни. Показатели считали значимыми при p<0,05. Результаты представлены в виде Me [P25-P75].

Результаты и обсуждение

Фолатный обмен – важный поставщик одноуглеродных фрагментов для жизненно важных клеточных процессов (регенерации метионина, биосинтеза пуриновых нуклеотидов). Нарушение метаболизма производных фолиевой кислоты вследствие недостаточной продукции S-аденозилгомоцистеина (SAM) в клетке способствует гипометилированию ДНК, что вызывает нарушение хромосомной сегрегации и анормальную генную экспрессию. Данные процессы могут лежать в основе канцерогенеза, и, следовательно, гены белков фолатного цикла могут быть рассмотрены в качестве генов-кандидатов, участвующих в развитии онкологических заболеваний [9, 10].

В результате исследования полиморфизма генов белков фолатного цикла нами обнаружены все искомые мутации в гомо- и гетерозиготном состоянии с частотным подчинением закону Харди – Вайнберга (табл. 1). Частоты генотипов и аллелей генов MTHFR (C677T), MTHFR (A1298C), MTR (A2756G), MTRR (A66G) не отличались в группах сравнения (в двух клинических и контрольной группе).

Учитывая, что суммарный эффект полиморфизмов разных генов фолатного цикла может значительно влиять на развитие патологического процесса, была проведена оценка всех исследуемых групп по генетическому индексу (табл. 2). Так, средняя сумма баллов у больных РМЖ и ПЗМЖ практически не отличалась от показателей контрольной группы (р>0,05). То есть для изучаемых заболеваний молочной железы аддитивный эффект исследуемых дефектов генов белков фолатного обмена отсутствует.

Однако нами отмечено, что среди 112 больных пролиферативными заболеваниями и раком молочной железы в геноме довольно часто встречаются определенные сочетания аллельных вариантов: MTHFR677T × MTHFR1298С × MTR2756A × MTRR66А - у 2 и MTHFR677T × MTHFR1298A × MTR2756G × MTRR66А у 4 исследуемых. Среди 144 здоровых женщин такие аллельные комбинации нами выявлены не были.

Было проведено исследование содержания ГЦ, цистеина и глутатиона в сыворотке крови у больных с ПЗМЖ и РМЖ (табл. 3). Уровень общего ГЦ у больных РМЖ и ПЗМЖ (р<0,05) был выше, чем у практически здоровых лиц, что, вероятно, связано с нарушением метаболизма метионина в злокачественных клетках, и, в частности, баланса между реметилированием и транссульфированием, а в случае с ПЗМЖ – усугублением пролиферативных и регрессивных изменений ткани молочной железы с ненормальным соотношением эпителиального и соединительнотканного компонентов, что может

Частота полиморфизма генов MTHFR(C677T), MTHFR(ai298C), MTR(a2756g), MTRR(a66g) в группах сравнения

Генотипы Аллели	Группы			χ2 (p)1	χ2 (p)2
	Контрольная (n=144)	ПЗМЖ1 (n=35)	РМЖ2 (n=77)
		MTHFR(C677T)
C/С	65 (45,1)	16 (45,7%)	39 (50,6%)	1,56 (0,46)	2,14 (0,34)
C/T	66 (45,8%)	18 (51,4%)	28 (36,4%)
T/T	13 (9%)	1 (2,9%)	10 (13%)
С	196 (0,681)	50 (0,714)	106 (0,688)	0,30 (0,59)	0,03 (0,87)
T	92 (0,319)	20 (0,286)	48 (0,312)
		MTHFR(A1298C)
A/A	73 (50,7%)	16 (45,7%)	40 (51,9%)	2,67 (0,26)	0,04 (0,98)
A/C	57 (39,6%)	18 (51,4%)	30 (39%)
С/С	14 (9,7%)	1 (2,9%)	7 (9,1%)
A	203 (0,705)	50 (0,714)	110 (0,714)	0,02 (0,88)	0,04 (0,84)
C	85 (0,295)	20 (0,286)	44 (0,286)
		MTR(A2756G)
A/A	94 (65,3%)	25 (71,4%)	53 (68,8%)	1,23 (0,54)	0,29 (0,87)
A/G	46 (31,9%)	10 (28,6%)	22 (28,6%)
G/G	4 (2,8%)	–	2 (2,6%)
A	234 (0,813)	60 (0,857)	128 (0,831)	0,76 (0,38)	0,24 (0,63)
G	54 (0,188)	10 (0,143)	26 (0,169)
		MTRR(A66G)
A/A	33 (22,9%)	9 (25,7%)	19 (24,7%)	2,64 (0,27)	0,25 (0,88)
A/G	78 (54,2%)	14 (40%)	39 (50,6%)
G/G	33 (22,9%)	12 (34,3%)	19 (24,7%)
A	144 (0,500)	32 (0,457)	77 (0,500)	0,41 (0,52)	0,00 (1)
G	144 (0,500)	38 (0,543)	77 (0,500)

Примечание: 1,2 (χ2-тест) – сравнение распределений частот генотипов и аллелей групп больных РМЖ и ПЗМЖ с соответствующим показателем в группе контроля.

таблица 2

характеристика групп наблюдения по генетическому индексу

Показатель

Группа контроля (n=144)

Группа больных ПЗМЖ (n=35) Группа больных РМЖ (n=77)

Генетический индекс              1,651

1,628

1,633

Примечание: (U-тест) – p>0,05.

таблица 3

содержание тиолов в сравниваемых группах, Me [p25-p75]

Показатель (мкмоль/л)

Группа контроля (n=144)

Группа больных ПЗМЖ

_(n=35)            Группа больных РМЖ (n=77)

Гомоцистеин

Цистеин

Глутатион

7,9 [7,1–8,7]

197,5 [161,8–236,3]

2,9 [2,5–3,4]

8,0 [7,6–8,8]*

168,4 [153,0–194,7]

3,2 [2,9–3,7]*

9,1 [8,4–9,9]*

190,4 [152,8–235,5]

3,8 [3,4–4,2]*

Примечание * – сравнение уровня тиолов с соответствующим показателем в группе контроля (U-тест) – p<0,05.

лежать в основе нарушения механизмов реализации противоопухолевой защиты организма. Важно отметить, что полученные результаты в клинических группах превышали оптимальный интервал уровня гомоцистеина – 4,5–7,9 мкмоль/л (в возрасте от 30 до 59 лет), который рассчитан для здоровых лиц K. Rasmussen [11]. Но вопрос о цитотоксическом эффекте ГЦ как физиологическом регуляторе уровня метилирования, где гипометилирование может приводить к повышенному уровню экспрессии онкогенов, а гиперметилирование ДНК опухолей подавлять активность генов-супрессоров, остается открытым, поскольку известно, что другие серосодержащие аминокислоты и аминотиолы, такие как цистеин, глутатион, цистеинилглицин, циркулирующие в больших концентрациях, не оказывают повреждающего действия на клетки [1, 10, 12, 13].

Концентрация глутатиона у больных РМЖ и ПЗМЖ (р<0,05) была выше, чем в контрольной группе. Повышение GSН и/или ферментов его метаболизма в плазме крови может свидетельствовать о гибели или апоптозе клеток, а дефицит – о напряжении антиоксидантной защиты, выступая в качестве наиболее раннего показателя усиления окислительных процессов в клетках и способствуя прогрессированию заболевания [14]. Глутатион – один из наиболее изученных антиоксидантов, но в отношении канцерогенеза его роль недостаточно исследована и может носить двойственный характер: как защитный, при участии в устранении и детоксикации канцерогенов, так и патогенный, когда повышенный уровень глутатиона, возможно, способен защитить опухолевые клетки и придать им устойчивость к ряду химиотерапевтических препаратов [15].

Между концентрацией ГЦ и GSH отмечалась сильная прямая линейно-корреляционная связь в обеих клинических группах (R=0,9, р<0,05), что, вероятно, является результатом ускоренного катаболизма серосодержащих аминокислот и может свидетельствовать о случае нарушения утилизации гомоцистеина, сопровождающегося оксидантным стрессом, а, следовательно, и повышением GSH.

Уровень цистеина у больных пролиферативными заболеваниями и раком молочной железы (р>0,05) был вариабелен и не отличался от значений в контрольной группе, что может быть объяснено недостаточным числом наблюдений и/или скрытыми нарушениями метаболизма тиолов. Однако определялась тенденция к снижению уровня Cys, что по результатам проспективного исследования S.M. Zhang et al. [16] может быть прогностическим признаком РМЖ.

Исследований с оценкой ассоциаций между уровнем тиолов и раком молочной железы очень мало в литературе, а результаты противоречивы. По данным нескольких работ [17, 18], у больных с различными видами рака, в частности молочной железы, яичников и поджелудочной железы, отмечалось повышение концентрации гомоцистеина. Вероятно, это связано с нарушением метаболизма метионина в злокачественных клетках и, в частности, баланса между реметилированием и транссульфированием, который определяет уровень гомоцистеина. Высокий уровень гомоцистеина провоцирует оксидантный стресс за счет нарушения лактат-пируватного обмена. То есть непосредственными источниками ГЦ в крови могут выступать пролиферирующие клетки, а из пищевых источников в кровь гомоцистеин не поступает [13]. В то же время в исследовании J. Lin et al. [19] описывается отсутствие связи между повышенным уровнем гомоцистеина и общим риском развития РМЖ, но при этом наблюдается положительная связь с уровнем цистеина. Можно предположить, что такая противоречивость данных связана с тем, что повышение уровня ГЦ – это и результат опухолевого роста, и его причина.

Таким образом, при оценке ассоциации концентрации тиолов в сыворотке крови как больных, так и здоровых исследуемых с носительством отдельных полиморфных маркеров генов фолат-ного обмена связи не выявлено. Однако можно констатировать различия в концентрации тиолов у исследуемых групп, с учетом наибольшего содержания сывороточного гомоцистеина и глутатиона у больных ПЗМЖ и РМЖ. Важно отметить, что у 6 носителей в геноме аллельных комплексов MTHFR677T × MTHFR1298С × MTR2756A × MTRR66А и MTHFR677T × MTHFR1298A × MTR2756G × MTRR66А из группы больных зарегистрирован наиболее высокий уровень гомоцистеина 9,6 [8,2–11,1] мкмоль/л, цистеина 242,3 [211,5–273,1] мкмоль/л и глутатиона 4,2 [3,4–4,9] мкмоль/л относительно других пациентов, а также группы контроля. Это дает возможность предположить влияние определенного сочетания аллельных вариантов генов фолатного обмена на уровень изучаемых тиолов, а, следовательно, и повреждение ДНК, что подтверждается результатами исследования A. Song et al. [18] и требует дальнейшего изучения данного вопроса на большей выборке.

Заключение

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии явной ассоциации отдельных генотипов и аллелей полиморфизма основных белков фолат-ного цикла с риском развития пролиферативных заболеваний и рака молочной железы. Однако определенные комбинации генотипов представляют особый интерес и могут быть связаны со значительным повышением уровня тиолов в сыворотке крови, что, вероятно, обусловлено нарушениями утилизации гомоцистеина и механизмов антиоксидантной защиты.