Молекулярно-генетические изменения тканей яичек пациентов с COVID-19

Демяшкин Г.А., Болдырев Д.В., Щекин В.И., Жиганова М.С. Молекулярно-генетические изменения тканей яичек пациентов с COVID-19. Морфологические ведомости. 2021;30(2):573 (2).573

Demyashkin GA, Boldyrev DV, Shchekin VI, Zhiganova MS. Molecular genetic changes in the testis tissues of Covid-19 patients. Morfologicheskie Vedomosti – Morphological newsletter. 2022;30(2):573 (2).573

Введение. Появление, а затем и чрезвычайно быстрый темп распространения новой коронавирусной инфекции COVID-19, вызванной вирусом SARS-CoV-2, привели к более 120 миллионам случаев инфицирования и около 2 500 000 смертей по всему миру [1]. Проникновение вируса SARS-CoV-2 в клетки происходит посредством специфического взаимодействия вируса с ангиотензин-превращающим ферментом 2 (далее - АПФ-2) и сериновой протеазой – фурином [2]. Обладая троп-ностью к этим белкам, локализующимся на мембранах различных клеток, SARS-CoV-2 может приводить к поражению многих органов, таких как почки, сердце, кишки, легкие и другие, поэтому COVID-19 можно рассматривать как системное заболевание [1]. При этом вопрос о поражении органов мужской репродуктивной системы, и в первую очередь процессов сперматогенеза, остается открытым.

Согласно проведенному ПЦР-анализу (далее – полимеразной цепной реакции – ПЦР) SARS-CoV-2 был обнаружен в тканях яичка, при иммуногистохимическом исследовании выявили увеличение концентрации рецепторов AПФ-2 в сперматогониях, клетках Лейдига и Сертоли [2-8]. Однако проведенные секвенирования генома (далее - scRNA-seq) мужских половых клеток и их микроокружения с целью обнаружения SARS-CoV-2 демонстрировали спорные результаты, в большинстве случаев следов вируса как в яичках, так и сперме не было обнаружено [9-11]. Тем не менее, авторы других работ утверждают обратное [12]. Учитывая минимальное количество информации о возможном повреждающем действии SARS-CoV-2 на мужские гонады, а также очевидный интерес к проблеме мужской фертильности в условиях широкого распространения заболевания COVID-19, проведение научных работ в данном направлении является остро актуальным.

Цель исследования: оценка молекулярно-генетического профиля образцов препаратов тканей яичек у пациентов с COVID-19.

Материалы и методы исследования. Дизайн эксперимента состоял в следующем. На основании анамнестических, клинических и морфологических данных были сформированы группы, каждая из которых включала подгруппы согласно возрастной периодизации ВОЗ (табл. 1). I группа наблюдения (n=96) в возрасте от 25 до 91 года, (в среднем 59 лет) – аутопсий-ный материал яичек пациентов, умерших с установленным клиническим и патологоанатомическим диагнозом коронавирусная инфекция (COVID-19, ПЦР+). Критерии исключения: эпидемический паротит, бесплодие, сепсис, бактериальная инфекция, носительство ВИЧ, вирусов гепатита В и С, Эпштейна-Барра. Группа наблюдения II (n=20) – архивные парафиновые блоки (2015–2016 гг.) аутопсийного материала нормальных яичек, полученных не позднее 6 часов после констатации биологической смерти, без макроскопических признаков наличия воспалительного и/или опухолевого процесса, все пациенты этой подгруппы имели по крайней мере одного генетически собственного ребенка и ранее не подвергались воздействию токсических веществ.

Таблица 1

Распределение наблюдений по группам, согласно возрастной периодизации ВОЗ (2014)

возраст|age	подгруппа|subgroup	n	возраст|age	подгруппа|subgroup	N
25–44 (молодой|young)	I – COVID-19	9	61–75 (пожилой|old)	I – COVID-19	43
	II – контроль | control	5		II – контроль | control	5
45–60 (средний|mature)	I – COVID-19	17	76–90 (старческий|senile); >90 (долгожители| centenarians)	I – COVID-19	27
	II – контроль | control	5		II – контроль | control	5

Количественные данные, полученные в ходе ПЦР в режиме реального времени (далее ПЦР-РВ), были проанализированы с использованием рангового дисперсионного анализа ANOVA.

Результаты исследования и обсуждение. При морфологическом исследовании яичек во всех образцах обнаружили признаки вирусного орхита (рис. 1). В большинстве извитых семенных канальцах наблюдали частые отслоения мужских половых клеток от базальной мембраны, которая была утолщена и разрыхлена. Перитубулярное пространство – отечное, с умеренной воспалительной инфильтрацией (плазмоциты, тучные клетки, лимфоциты, единичные нейтрофилы и эозинофилы). Кроме того, отмечали обильные внутрисосудистые тромбозы и слущение эндотелио-цитов, снижение количества половых клеток; утолщение и отек интерстициальной ткани, миграцию плазмоцитов, микротромбы в просвете кровеносных сосудов мелкого калибра.

Во всех изученных образцах (n=96) в ткани яичка при ПЦР-РВ обнаружен SARS-CoV-2, в то время как в ткани придатка (n=96) она была отрицательная. При ПЦР-РВ анализе экспрессии АПФ-2 и фу-рина в тканях яичка и придатка яичка (n=96) показали приблизительно схожие паттерны экспрессии, нормализованные по GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназе, табл. 3). В ткани яичка у пациентов с COVID-19 отмечали увеличение экспрессии АПФ-2 по сравнению с контролем почти в 7 раз – 8,46±0,85 против 1,23±0,02 (p<0,01, соответственно). В SARS-CoV-2-позитивных образцах относительная экспрессия АПФ-2 в тканях яичка была выше в 1,8 раз, чем в тканях придатка яичка (4,74±0,61, p<0,01). При распределении экспрессии АПФ-2 отмечали тенден- цию к ее уменьшению с возрастом в обеих группах (табл. 4).

Экспрессия фурина в тканях яичка у COVID-19-пациентов была выше почти в 3 раза по сравнению с мужчинами контрольной группы – 6,18±0,42 против 2,18±0,68 (p<0,01, соответственно). В тканях яичка экспрессия фурина превалировала в 1,5 раза над значениями в тканях придатка яичка (4,22±0,54, p<0,01), а также не зависела от возраста (табл. 5).

Рис. 1. Микроскопическая картина яичка (случай К., 58 лет). Обозначения: стрелка – миграция плазмоцита. Окр.: гематоксилином и эозином. Ув.: х 1000.

Настоящее исследование посвящено изучению SARS-CoV-2 вирусной нагрузки в яичках и придатках яичек у пациентов с подтвержденным диагнозом COVID-19 в разных возрастных группах с использованием ПЦР-РВ. При ПЦР-РВ

SARS-CoV-2 был обнаружен во всех изучаемых образцах (n=96) тканей яичка, что частично согласуется с результатами других исследований и свидетельствует о по-

Таблица 2

Используемые праймеры для SARS-CoV-2, АПФ-2 и фурина

гены | genes	5´-праймер | 5´-primer	3´-праймер | 3´-primer
SARS-CoV-2	WuhanCoV-spk2-f 5'-TTTCCTCGTGAAGGTGTCTTTGT-3 '
	WuhanCoV -spk2-r 5'-TGTGGTTCATAAAAATTCCTTTGTG-3 '
	WuhanCoV-spk2-hex-p5'-HEX-TCAAATGGCACACACTGGTTTGT-BHQ1
АПФ-2 | ACE-2	ACCTCACTATTTGAAAGCACTTGGT	GCTTGCTTGAGCAGGAAGTTTATTT
фурин | Furin	CCACATGACTACTCTGCTGATGG	CGAAGTGAACTTGGTCAGCGT

Таблица 3

гены | genes	яичко | testis		придаток яичка | epididymis		p
	I – COVID-19	II – контроль | control	I – COVID- 19	II – контроль | control
АПФ-2|ACE-2	8,46±0,85	1,23±0,02	4,74±0,61	1,28±0,42	p<0,01
фурин | Furin	6,18±0,42	2,18±0,68	4,22±0,54	2,56±0,82	p<0,01

Таблица 4

Распределение экспрессии АПФ-2 при ПЦР-РВ по возрастам в условных единицах

возраст | age	подгруппа | subgroup	АПФ-2 | ACE-2	возраст | age	подгруппа | subgroup	АПФ-2 | ACE-2
25–44 years (молодой | young)	I – COVID-19	8,54±0,12 *	61–75 years (пожилой | old)	I – COVID-19	8,49±0,21 *
	II – контроль | control	2,79±0,11		II – контроль | control	0,85±0,14
45–60 years (средний | mature)	I – COVID-19	8,51±0,14 *	76–90 years (старческий | senile); > 90 (долгожители | centenarians)	I – COVID-19	8,39±0,33 *
	II – контроль | control	1,34±0,21		II – контроль | control	0,52±0,22

Примечание: * - достоверность различий с показателями контроля p<0,01

Таблица 5

Распределение экспрессии фурина при ПЦР-РВ по возрастам в условных единицах

возраст | age	подгруппа | subgroup	фурин | Furin	возраст | age	подгруппа | subgroup	фурин | Furin
25–44 years (молодой | young)	I – COVID-19	5,43±0,11 *	61–75 years (пожилой | old)	I – COVID-19	6,23±0,11 *
	II – контроль | control	4,17±0,12		II – контроль | control	4,21±0,12
45–60 years (средний | middle)	I – COVID-19	5,52±0,12 *	76–90 years (старческий| senile); > 90 (долгожители| Centenarians)	I – COVID-19	5,69±0,13 *
	II – контроль | control	4,18±0,11		II – контроль | control	4,22±0,13

Примечание: * - достоверность различий с показателями контроля p<0,01

Результаты ПЦР-РВ на АПФ-2 и фурин в условных единицах

тенциальной уязвимости мужской половой железы к этому антигену. Однако, вероятность проникновения вируса через гематотестикулярный барьер можно рассматривать лишь гипотетически.

В литературе описаны случаи, подтверждающие способность некоторых вирусов приводить к развитию спермато-генной недостаточности в результате прямого воздействия на мужские половые клетки, сопровождающиеся местными воспалительными реакциями. Например, при паротите, вирусных инфекциях Эбола, Зика и SARS-CoV. Однако, SARS-CoV-2 не был найден в адлюминальном ком-партменте извитых семенных канальцев. Проводя аналогию между полученными данными по вирусам паротита, Эбола, Зика, результатами настоящего и ранее про- веденных исследований, можно высказать предположение о возможности SARS-CoV-2 проникать через гематотестикулярный барьер и поражать мужские половые клетки [12-13, 7].

Другой механизм, который также не исключается в случае COVID-19 - цито-киновое воздействие. При эпидемическом паротите увеличивается продукция цитокинов в основном TNF-α, IL-6 и нарушается функционирование гематотестикуляр-ного барьера, что снижает количество контактных белков клеток Сертоли, в первую очередь ZO-1 белка приводя к де-компартментализации семенных канальцев (клетки Сертоли являются таргетными для вируса) [14]. Вирус Зика, также снижает проницаемость гематотестикулярного барьера, что приводит к поражению кле- ток Сертоли и ухудшению барьерных свойств мужских гамет [15]. При инфицировании вирусом Эбола в гематотестику-лярном барьере и микроокружении наблюдается повышение активности иммунокомпетентных клеток [13]. При этом ПЦР-РВ на указанные инфекции в тканях яичек демонстрировали присутствие вирусной РНК [15-19].

SARS-CoV-2 не был выявлен в придатках яичек. Этот факт свидетельствует о способности вируса инфицировать только клетки, характерные для паренхимы мужских гонад, а именно – половые клетки, клетки Сертоли и Лейдига, и позволяет исключить поражение стромального компонента, представленного рыхлой волокнистой соединительной тканью в обоих органах. Учитывая, что придаток яичка является резервуаром для дозревания сперматозоидов, то полученный отрицательный результат на SARS-CoV-2 позволяет считать потенциально таргетными для SARS-CoV-2 мужские половые клетки, не достигшие фазы формирования.

Возбудитель COVID-19 преимущественно поражает органы дыхательной и мочевыделительной систем, желудочнокишечного тракта, сердце [20-22], тенденция к инфицированию которых может быть обоснована значительной экспрессией АПФ-2 и фурина в аппарате Гольджи, за счет которых вирус способен проникать в клетки. SARS-CoV-2 содержит внеклеточный, трансмембранный и внутриклеточный домены. Первый образован субъединицей, которая связывается с мембранным рецептором АПФ-2 через рецептор-связывающий домен, вторая субъединица способствует образованию комплекса «вирус-рецептор» [2]. Нами наблюдалось значительное увеличение экспрессии генов, кодирующих молекулярные компоненты АПФ-2 и фурина, что свидетельствует о потенциальной таргетности тканей яичек к проникновению в них и воздействию SARS-CoV-2. В то же время, выявленное снижение экспрессии АПФ-2 с возрастом можно связать с физиологическими процессами старения яичка. АПФ-2 оказывает регулирующее действие на 5-гидрокситриптаминовый 3A (HTR3A) и холинергический Nicotinic Alpha 1 (CHRNA1) рецепторы. HTR3A опосредованно влияет на апоптоз через продукцию TNF-α, увеличивая секрецию серотонина. CHRNA1 в очаге воспаления взаимодействует с лейкоцитами. Можно предположить, что увеличение экспрессии АПФ-2 при воспалительной реакции в яичках, вызванной SARS‐ CoV‐2 приведет к дисфункции сперматогенеза и в целом к тестикулярной недостаточности.

Анализируя паттерн экспрессии фурина в ткани яичка, мы наблюдали повышенное содержание этой протеазы, что возможно свидетельствует об увеличении вирусной нагрузки, так как он расщепляет последовательность S-белка SARS-CoV-2, способствуя внутриклеточной инвазии. Принимая во внимание данные по секвенированию scRNA-seq из публичных карт «The Human Protein Atlas», согласно которым в норме АПФ-2 и фурин на 65–80% экспрессируются в мужских половых клетках, то с высокой долей вероятности можно утверждать, что они являются клетками-мишенями для SARS-CoV-2. Это предположение было отчасти подтверждено в одном из последних исследований, в котором при помощи секвенирования технологией Single-cell transcriptome scRNA-seq на основании протоколов «Gene Expression Omnibus» и «Sequence Read Archive» была выявлена высокая экспрессия АПФ-2 в сперматогониях, клетках Лейдига и Сертоли [7].

Подводя итоги исследования с абсолютной уверенностью можно утверждать об уязвимости тканей мужских половых желез к вирусной инфекции SARS-CoV-2, что следует из результатов ПЦР-РВ. Принимая во внимание собственные результаты и ранее полученные данные других исследователей, нами предлагаются некоторые гипотезы о таргетности отдельных тканевых структур яичек для этой инфекции, в первую очередь мужских гамет, однако данный вопрос остается по-прежнему окончательно не решенным и требует дальнейшего изучения.

Заключение. Таким образом по результатам полимеразной цепной реакции в режиме реального времени на РНК ви- руса SARS-CoV-2, оценки экспрессии АПФ-2 и фурина, можно с большой вероятностью утверждать о присутствии вируса в тканях яичка, а также о его потенциальной таргетности к мужским половым клеткам, клеткам Сертоли и Лейдига.