Молекулярно-генетические механизмы сигнального каскада RAS-RAF-MEK-ERK, связанные с развитием опухолевого процесса и назначением таргетных препаратов при колоректальном раке

Cite as: Toropovsky A.N., Pavlova O.N., Viktorov D.A., Nikitin A.G. Molecular-genetic mechanisms of the signal cascade RAS-RAF-MEK-ERK associated with the development of the tumor process and the purpose of targeted drugs for colorectal cancer. Bulletin of the Medical Institute REAVIZ. Rehabilitation, Doctor and Health. 2021;4(52):25-35.

Рак толстой и прямой кишки (РТПК) или колоректальный рак (КРР) является одним из самых распространенных злокачественных новообразований у человека. В России отмечается неуклонный рост заболеваемости и смертности от КРР. По данным В.П. Земляного ежегодно в мире регистрируется около 800 000 пациентов с колоректальным раком и 440 000 смертей от этого заболевания [1]. По статистическим данным на 2015 год в России диагностировали КРР у более чем 68 000 человек, а смертность составила – более 42 000 случаев [2]. Таким образом, КРР занимает 3-е место по заболеваемости как у мужчин, так и у женщин и 3-е место в структуре смертности от онкологических заболеваний у мужчин и 2-е – у женщин [3]. Причем среди вариантов колоректального рака наиболее встречаемым и смертоносным является рак толстой кишки (РТК), так как это заболевание может значительное время протекать бессимптомно и, как следствие, у каждого третьего больного на момент установления диагноза отмечается генерализация опухолевого процесса. Высокая смертность при РТК объ- ясняется частым метастазированием опухоли, в основном в печень и легкие, нередко даже на первых стадиях заболевания [4].

Основой многих онкологических заболеваний являются нарушения в регуляции клеточного цикла, которые приводят к безудержному росту клеток и формированию опухолей. Причины нарушений клеточного деления заключаются чаще всего в соматических мутациях – изменениях исходной генетической информации соматических клеток. Нарушение экспрессии генов и различные хромосомные перестройки (транслокации, делеции, инверсии и амплификации) могут возникнуть в структуре протоонкогенов, генах ростовых факторов, клеточных рецепторов и других биологически активных генах. Данные нарушения приводят к потере контроля над работой протоонкогенов в составе нормального генома и запускают процессы злокачественной трансформации. Нарушения экспрессии белков, контролирующих процессы апоптоза, пролиферации и ангиогенеза, эпигенетические изменения ДНК белков, контролирующих жизнедеятельность опухолевых клеток, влияют на клиническое течение опухолевого процесса. Доказано, что различия в экспрессии определенных белковых маркеров могут объяснить, почему сравнимые по стадии, гистологической структуре и степени злокачественности опухоли различаются по течению заболевания. Раннюю диагностику рака толстой кишки до настоящего времени нельзя считать удовлетворительной, так как выявляе-мость опухоли на ранних стадиях низкая [5].

Проведенный анализ литературы показывает, что пусковым механизмом онкогенеза большинства новообразований толстой кишки являются нарушения генетического аппарата клетки. В то же время существует значительный разрыв между научно-обоснованными данными в области молекулярной генетики канцерогенеза и практическим применением их в работе врачей [6].

Рак толстой кишки (РТК) представляет собой гетерогенную группу опухолей, отличающихся как механизмами канцерогенеза и, следовательно, молекулярными изменениями, так и прогнозом течения болезни, и особенностями терапии. Уже сейчас для выбора тактики лечения необходимо учитывать не только клинические факторы, такие как распространение опухоли, функциональный статус пациента, но и молекулярный профиль заболевания.

Одна из основных причин, влияющих на развитие этого заболевания, – эпигенетические нарушения регуляции генов. Определение этих нарушений имеет большое значение для ранней диагностики раковых заболеваний, так как нарушенная регуляция генов вследствие аберрантного метилирования ДНК является ключевой стадией в развитии опухоли. При этом, метилированная ДНК является достаточно информативным биомаркером и может быть легко измерена в образцах крови или плазмы. Метилирование обширных регионов CpG-островков – основное эпигенетическое изменение, характерное для процессов канцерогенеза при КРР [7].

Важно отметить, что маркерные молекулы для диагностики заболеваний не всегда лежат в основе развития заболеваний. Данное утверждение в особенности справедливо для маркеров метилирования. В ряде работ было показано отсутствие прямой корреляции между аберрантным метилированием и выраженностью экспрессии генов [8, 9].

В патогенезе КРР главным является пролиферация эпителиальных клеток слизистой оболочки кишечника. Ранее было показано, что в 80 % случаев РТПК есть гиперэкспрессия EGFR, которая приводит к усиленному росту и делению клеток опухоли вследствие гиперактивации RAS-RAF-MEK-ERK сигнального каскада [10].

RAS-RAF-MEK-ERK сигнальный путь представляет собой цепь последовательно взаимодействующих белков, которые передают сигнал с поверхности клетки от кле- точного рецептора внутрь ядра клетки к ДНК. Этот сигнальный путь включает в себя много белков, в том числе MEK (Mitogen-activated protein kinase). Участники сигнального пути взаимодействуют между собой с помощью фосфорилировния и дефосфорилирования. Эти процессы и являются механизмами активации и деактивации белков сигнального каскада.

Началом сигнального пути является внеклеточный домен рецептора эпидермального фактора роста (EGFR, Epidermal Growth Factor Receptor), связанный с тирозинкиназой, которая при связывании лиганда с рецептором активирует фосфорилирование тирозиновых остатков внутриклеточного домена рецептора EGFR (рис. 1). Кроме EGFR, в качестве рецептора могут выступать рецептор тирозинкиназы Trk A/B, рецептор фактора роста фибробластов FGFR (Fibroblast Growth Factor Receptor) и рецептор тромбоцитарного фактора роста PDGFR (Platelet-18 Derived Growth Factor receptors). С фосфорилированными тирозиновыми остатками рецептора взаимодействует белок GRB2 (Growth factor receptor-bound protein 2) посредством домена SH2 (Src Homology 2) [11].

Далее GRB2 взаимодействует посредством домена SH3 с белком SOS (Son of Sevenless) из семейства GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor). Комплекс GRB2 и SOS приводят к активации последнего [12]. Активированный SOS способствует диссоциации ГДФ от белков семейства Ras, в том числе KRAS. К семейству RAS относятся четыре белка, кодируемые тремя генами: NRAS, HRAS, KRAS (4A и 4B). Далее RAS, являясь ГТФазой, связывает ГТФ и принимает активную форму. Активированный RAS затем активирует белок серин-треониновую киназу RAF (Rapidly Accelerated Fibrosarcoma), в том числе BRAF [13]. RAF киназа фосфорилирует и активирует киназу MEK (Mitogen-activated protein kinase kinase), которая в свою очередь активирует MAPK. MAPK может фосфорилировать и активировать многих последующих посредников передачи сигнала. Например,

MAPK активирует RSK (40S ribosomal protein S6 kinase), регулируя трансляцию мРНК, или активирует факторы транскрипции, такие как c-Myc, CREB (cAMP response element-binding protein). Все эти процессы в итоге запускают клеточную пролиферацию, ангиогенез и выживание клеток.

RAS – малая ГТФаза, которая присутствует во всех клетках организма. Состоит из шести β -цепей и пяти α -спиралей, имеет G-домен, состоящий из 166 аминокислот и принимающий непосредственное участие в связывании ГТФ и ГДФ; и С-домен, имеющий сродство к мембране. Этот компонент RAS-RAF-MEK-ERK сигнального пути выполняет функцию «переключателя» сигнального каскада, переходя из неактивной формы в активную и обратно. Этот переход сопровождается гидролизом ГТФ (активная форма) – ГДФ (не активная форма). Однако сам по себе RAS имеет очень низкую ГТФазную активность и нуждается в катализаторе, которым является белок GAP, значительно увеличивающий гидролиз ГТФ. Этот белок имеет петлю, в составе которой находится аминокислота Arg789, которая и взаимодействует с β -фосфатом ГТФ, ускоряя гидролиз. Важное значение в процессе гидролиза имеют аминокислотные остатки Gly12, Gly13 и Gln61 белка RAS. Gly12 и Gly13 на прямую не принимают участие в гидролизе, но атом водорода R-группы этих аминокислотных остатков занимают положение около каталитической петли GAP белка. И если в результате мутации происходит замена аминокислоты, то это приводит к стерическим затруднениям, вследствие которых каталитическая петля GAP белка не может занять нужную позицию. Это приводит к снижению скорости гидролиза ГТФ, вследствие чего белок RAS дольше остается связанным с ГТФ в активированном состоянии. Аминокислота белка RAS Gln61 хотя и находится далеко от места связывания ГТФ, но исполняет функцию активации молекулы воды как первичного нуклеофила [14–17]. Таким образом, мутации аминокислотных остатков в позиции 12, 13 и 61 приводят к снижению ГТФазной активности RAS [18].

Рис. 1. Схема RAS-RAF-MEK-ERK сигнального пути. Р обозначает фосфорилирование,

Fig. 1. Scheme of the RAS-RAF-MEK-ERK signaling pathway. P stands for phosphorylation,

Семейство RAF белков представляет собой три серин-треониновые протеин-киназы: A-RAF, B-RAF, RAF-1. Киназа BRAF состоит из 766 аминокислот, образующих три консервативных домена: CR1, CR2, CR3 (Concerved Region). Домен CR3 являет- ся каталитическим центром, домен CR1 является аутоингибитором CR3 [19], а домен CR2 связывает их между собой. CR3 состоит из аминокислотных остатков 457-717, из которых формируются 2 участка: N-участок, связывающий АТФ, и С-участок, связывающий субстратные белки и состоящий из аминокислотных остатков 535-717 [20]. N-участок в своем составе имеет Р-петлю, которая стабилизирует фосфатную группу АТФ при его связывании. С-участок содержит активационную петлю, состоящую из аминокислотных остатков 596-600, функция которой заключается в блокировании киназы в неактивном состоянии, пока Р-петля вновь не свяжет молекулу АТФ [21]. Большинство из обнаруженных на сегодняшний день более 30 мутаций RAF, в том числе мутации 600 кодона гена BRAF, сосредоточены в области Р-петли, N-участка и фланкирующих районах [21]. Эти мутации нарушают взаимодействие Р-петли и активационной петли С-участка и, как следствие, приводят к отсутствию «блокировки» RAF киназы в неактивном состоянии и поэтому происходит постоянная активация этого белка. В целом EGFR представляет собой трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой 170 кДа, состоящий из внеклеточного домена с двумя богатыми цистеином областями, трансмембранного домена и внутриклеточного домена, обладающего тирозинкиназной активностью [22].

В роли лигандов EGFR наиболее часто выступают ростовые факторы EGF и фактор некроза опухоли-a (TGF-a), а также ам-фирегулин, эпирегулин, HB-EGF и b-целлюлин. Они взаимодействуют с рецептором, вызывая его гомодимеризацию (связывание лигандом двух идентичных рецепторов) или гетеродимеризацию (связывание мономера EGFR с другим представителем семейства, например, HER2 или HER3) [23–25]. В результате происходит активация тирозинкиназы во внутриклеточном домене с последующим аутофосфорилированием рецептора и инициацией каскадов сигнальной трансдукции RAS-RAF-MEK-ERK сигнального пути, участвующего в процессе пролиферации и опухолевой прогрессии (активация инвазии, метастазирования, включение антиапоптозных механизмов) [10].

Таким образом, каскад (RAS-RAF-MEK-ERK путь) является путем, который регулирует клеточную пролиферацию, клеточный цикл и миграцию клетки. При развитии рака у человека мутации семейства RAS/RAF наиболее часто являются причиной нарушения регуляции трансдукции сигнала через этот путь. Согласно современным данным около трети всех злокачественных новообразований ассоциированы с мутациями в генах семейства RAS. Однако частоты мутаций этих генов значительно варьируют в зависимости от определенного типа рака: активирующие мутации KRAS часто обнаруживаются при немелкоклеточном раке легкого (15–20 %), раке толстой кишки (40 %) и аденокарциноме поджелудочной железы (95 %); NRAS-мутации выявляются с высокой частотой в гематологических злокачественных новообразованиях (20–30 %) [26].

Гены семейства RAS (HRAS, KRAS и NRAS) являются клеточными протоонкогенами, кодирующими белки с молекулярной массой 21kDa [27], которые принадлежат к суперсемейству малых гуанозинтрифосфатаз (ГТФаз). На уровне аминокислотной последовательности белки семейства RAS имеют высокую степень гомологии (приблизительно 80 %) и обладают способностью связывать и осуществлять гидролиз гуаниловых нуклеотидов [28]. Эти белки принимают сигналы с поверхности клеток и передают их внутрь клеток, регулируя клеточный ответ на внешние стимулы посредством активации сигнальных путей, включая RAF-MAPК, PI3К и Ral-GEF (Ral-GDS) [29].

Сигнальные пути, активируемые белками RAS, участвуют в регуляции таких клеточных процессов, как пролиферация, рост, дифференцировка, миграция, апоптоз и выживание [30].

Установлено, что соматические точко-вые мутации генов RAS, приводящие к замене аминокислот в 12-й, 13-й или 61-й позициях, присутствуют в 20–30 % злокачественных опухолей человека [31]. Такие молекулярные изменения обусловливают нарушение ГТФазной активности белка

RAS, что проявляется в его конститутивном активном состоянии. Последнее в свою очередь ведет к активации нисходящих сигнальных каскадов даже в отсутствие внеклеточных стимулов и, как следствие, к злокачественной трансформации клеток.

При анализе генома пациентов с КРР очень часто выявляются мутации (частота до 40 %) [32]. KRAS является геном, кодирующим один из белков, играющих важную роль в сигнальной системе рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), а также регулирует белки, находящиеся далее в сигнальной системе EGFR, которые связаны с выживаемостью опухоли, ангиогенезом, пролиферацией и метастазированием [33].

При метастатическом колоректальном раке почти 60 % пациентов имеют нормальную сигнальную систему EGFR и дикий тип гена KRAS; остальные 40 % имеют мутантный тип гена [32].

NRAS также относится к семейству онкогенов RAS, ген которого расположен на первой хромосоме [29]. NRAS отличается от KRAS концевым участком белковой молекулы, что определяет его отличие в транспортировке, во внутриклеточном расположении и функции [34]. Мутация гена NRAS встречается в 3–5 % случаях КРР, чаще в кодоне 61. Мутации KRAS и NRAS взаимоисключающие [34, 35]. Наличие мутации в гене NRAS определяет наличие резистентности к анти-EGFR-терапии КРР [35–37].

Мутации в гене KRAS в опухолях толстой кишки встречаются в 30–60 % случаев. Наиболее часто мутации KRAS определяются в экзоне 2, кодонах 12 и 13. Однако описаны мутации в экзоне 3, кодоне 61 и в экзоне 4, кодонах 117 и 146. Мутации в гене NRAS (в идентичных экзонах и кодонах) при КРР составляют до 5 % [38].

Хирургическое лечение КРР играет главную роль в излечении больных, однако пациенты с III стадией рака нуждаются в адъювантной химиотерапии (АХТ), что было про-демонcтрировано во множестве рандомизированных исследований. Таргетная терапия, по сравнению с конвенциональной химиотерапией, имеет ряд преимуществ: индивидуализация назначения, более низкая токсичность, таблетированные формы большинства препаратов исключают необходимость госпитализации и позволяют больным радикально не менять образ жизни.

В качестве основных мишеней целенаправленной терапии могут выступать многочисленные элементы сигнальных путей, связанные с регуляцией клеточного цикла и апоптоза, нарушение которых ассоциировано со злокачественным ростом. Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), или HER1, – трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой 170 kD, обладающий тирозинкиназной активностью, является наиболее хорошо изученной мишенью.

Основные механизмы активации EGFR-зависимых сигнальных путей в опухолевых клетках обеспечиваются: мутацией тирозинкиназного домена гена EGFR и, как следствие этого, его аутоактивацией при отсутствии факторов роста, приводящей к неконтролируемой пролиферации; гиперэкспрессией EGFR; избыточной продукцией факторов роста – лигандов EGFR (TGF-a, EGF) [38].

Существует несколько вариантов блокирования онкогенного эффекта, реализуемого через активированный EGFR: 1) использование низкомолекулярных ингибиторов, способных воздействовать на внутриклеточный, несущий мутацию, домен EGFR, и прерывать процесс тирозинкиназного фосфорилирования; 2) применение рекомбинантных пептидных лигандов EGF и/или TGF-a, конъюгированных с проникающими внутрь клетки цитотоксинами; 3) использование моноклональных антител, связывающих экстрацеллюлярный участок рецептора или образующих неактивный комплекс с его лигандами EGF и TGF-a. В настоящее время к клиническому применению разрешены девять ингибиторов передачи сигнала в клетки (иматиниб, сунитиниб, сорафениб, лапати-ниб, гефитиниб, эрлотиниб, дазатиниб, ни-лотиниб, пазопаниб) и пять моноклональных антител (трастузумаб, ритуксимаб, бева-цизумаб, цетуксимаб, панитумумаб) [39].

Таким образом, для лечения больных КРР успешно применяются препараты на основе моноклональных антител к EGFR, которые, связываясь с ним на поверхности клетки, блокируют запуск сигнального каскада и таким образом препятствуют росту и развитию опухоли [40]. Эффективность лечения этими препаратами зависит от молекулярногенетических изменений в опухоли: статуса EGFR, наличия мутаций в других участниках сигнального каскада – онкогенах KRAS и BRAF – и некоторых других факторов. При отсутствии мутаций в гене KRAS эффективность лечения РТПК очень высока, увеличивается средняя продолжительность жизни, уменьшается количество рецидивов. В то же время при наличии в клетках опухоли активирующих мутаций в гене KRAS использование анти-EGFR антител не приводит к положительным результатам [41]. В 30–40 % случаев РТПК выявляются следующие мутации в 12 и 13 кодонах KRAS (85–90 %), которые коррелируют с резистентностью опухолей к анти-EGFR терапии: G12C, G12S, G12R, G12A, G12V, G12D, G13D. Значительно реже выявляются мутации в кодонах 61 (5 %) и 146 (5 %) [41, 42]. Таким образом, тест на наличие мутации гена KRAS необходим пациентам с РТПК для оценки возможности применения таргетной терапии анти-EGFR антителами [41, 42].

Активирующие мутации BRAF встречаются, по разным данным, в 5–15 % случаев РТПК, в 95 % случаев это мутация V600E

[43–46]. Существуют противоречивые данные о предсказательной роли мутации BRAF V600E в отношении ответа опухоли на анти-EGFR терапию и прогностической значимости в отношении прогрессирования заболевания [47, 48]. В настоящее время имеются немногочисленные исследования частоты мутаций в гене KRAS и одно исследование мутаций в гене BRAF при РТПК у российских пациентов [43–46].

Доказано, что активация генов семейства RAS, за счет мутаций сводит на нет эффект ингибирования EGFR моноклональными антителами при терапии мета-стазированного колоректального рака (мКРР) [49–52].

Таким образом, эффективность тар-гетной терапии при КРР зависит от статуса EGFR, наличия мутаций в онкогене KRAS и некоторых других факторов. При отсутствии мутаций в гене KRAS замедляется прогрессия заболевания (9,6 против 8,0 мес.) и увеличивается общая продолжительность жизни больного (23,9 против 19,7 мес.) [53]. В тоже время, в случае наличия активирующих мутаций в гене KRAS в клетках опухоли больного, использование анти-EGFR антител не приводит к положительным результатам [41, 42].

Таким образом, современные возможности ранней диагностики РТК, прогнозирования течения заболевания, определения чувствительности/резистентности к лекарственным препаратам основаны на индивидуальных наследственных и соматических молекулярно-генетических характеристиках.