Молекулярно-генетические методы прогноза и течения рака гортани

Согласно концепции развития здравоохранения России, злокачественные новообразования относятся к группе наиболее социально значимых заболеваний, среди которых 5-е место занимают опухоли головы и шеи (ОГШ). Следует отметить, что основными органами поражения для ОГШ являются гортань и гортаноглотка. Причем лидирующие позиции занимают злокачественные опухоли гортани, составляющие 65–70 %, а в структуре общей онкологической заболеваемости – 2 %. Анализ темпов прироста рака гортани (РГ) показал тенденцию к увеличению его удельного веса в структуре онкологической патологии. Так, в России за последние 10 лет частота встречаемости РГ увеличилась на 20 %, а в 2008 г. данный показатель составил 6655 новых случаев, из которых 66 % – лица СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2010. №5 (41)

трудоспособного возраста [2, 7]. Необходимо отметить, что эти показатели существенно превосходят уровень заболеваемости в странах Западной Европы и Северной Америки, где он колеблется от 0,8 до 8 % [6].

Важным фактором, влияющим на высокую частоту встречаемости РГ в популяции, является бессимптомное его течение, отмеченное у 35 % больных, около 70 % которых обращаются в специализированные учреждения с уже распространенным опухолевым процессом [6, 8]. Остаются неудовлетворительными и отдаленные результаты лечения этих пациентов, поскольку 5-летняя выживаемость при III стадии опухолевого процесса не превышает 50 %, при IV – 30 % [20]. Многочисленными эпидемиологическими исследованиями показано, что мощными ин- дукторами трансформации эпителия гортани являются курение и алкоголь [14, 24].

Однако в последние годы все большее внимание ученых привлекает вирусная теория канцерогенеза слизистой гортани, что связано с частым выявлением последовательностей генома и белков онкогенных вирусов папилломы человека (ВПЧ) и Эпштейна-Барр (ВЭБ) как в патологически измененной, так и в морфологически нормальной слизистой оболочке гортани больных предопухолевыми заболеваниями и раком [5, 10, 23, 29, 33, 39, 48]. Так, согласно современным данным, 20–50 % опухолей головы и шеи ассоциировано с ВПЧ-инфекцией, с последующим развитием злокачественного процесса в 8–20 % случаев [1, 10, 25, 43, 49, 53, 54, 56]. Кроме того, такие веские аргументы, как повсеместная распространенность ВПЧ-инфекции (по данным ВОЗ, ежегодно в мире диагностируется около 2,5–3 млн случаев инфицирования), различная частота обнаружения вируса среди больных и здоровых лиц, высокий онкогенный потенциал, а также специфичность в отношении эпителия респираторного тракта, позволяют говорить об актуальности проблемы ВПЧ-ассоциированных неоплазий гортани. Однако значимая, если не ведущая, роль в развитии РГ принадлежит таким гиперпластическим процессам, как папилломатоз гортани (ПГ) и хронический ларингит (ХГЛ), объединяемые термином «предраковые заболевания» (ПЗ). Так, в общей структуре воспалительных заболеваний ЛОР-органов на долю ХГЛ приходится 8–10 %, а частота встречаемости данной патологии в мире колеблется от 65 до 70 %, с последующей малигнизацией в 5–30 % случаев в сроки 10–15 лет [9].

Следует отметить, что на данный момент не определены параметры включения лиц в группу риска по развитию, а также система динамического контроля за группой больных с повышенным риском возникновения РГ. Отсутствуют и адекватные меры безопасности на предприятиях, чья деятельность связана с подверженностью сотрудников воздействию вредных летучих/мелкодисперсных потенциально канцерогенных веществ. Онкологическая служба не располагает арсеналом четких молекулярно-генетических критериев оценки и диагностических/прогностических маркеров риска, позволяющих проводить раннюю диагностику рака гортани и способных прогнозировать течение злокачественного заболевания.

Таким образом, вышесказанное определяет актуальность исследований, направленных на расширение и повышение специфичности и чувствительности методов ранней диагностики рака гортани, т.е. скрининг лиц с предопухолевыми заболеваниями гортани и поиск молекулярнобиологических и вирусо-генетических маркеров, способных с высокой точностью предсказать как вероятность развития, так и течение злокачественного процесса.

Одним из перспективных направлений в создании панели маркеров риска развития РГ могут выступать события, наиболее часто регистрируемые на ранних этапах канцерогенеза, такие как амплификация, делеция, потеря гетерозиготности, а также полиморфизм некоторых генов, непосредственно участвующих в клеточном цикле или выступающих в роли регуляторов посттранскрипционных модификаторов их продуктов. Следует также разграничивать понятия «количество копий гена» и «уровень экспрессии», поскольку не во всех злокачественных опухолях гортани между ними наблюдается прямая взаимосвязь. Так, в 26 % клеточных линий, полученных из опухолей больных раком гортани и миндалин, отмечена амплификация генов, участвующих в регуляции клеточного цикла (CD109 и MY06, расположенных на 6 хромосоме, JAK 2 и CD274 – на 9 хромосоме, АPIP и TRAF6 – на 11 хромосоме), но лишь в 9 % из них наблюдалась сверхэкспрессия указанных генов [21]. Согласно вышесказанному можно предположить непричастность изученных в работе генов к канцерогенезу эпителия гортани или их незначительный вклад в патогенез заболевания. В то же время группа финских ученых показала значимую ассоциацию между количеством копий генов и уровнем их экспрессии у больных РГ [31].

Явление амплификации генов характерно не только для доброкачественных опухолей гортани, но с высокой частотой регистрируется при предраковых состояниях и раке гортани, являясь, согласно данным некоторых ученых, предпочтительным маркером риска малигниза- ции [15, 21]. В частности, J. Rodrigo et al. [50] при выборе маркера исхода заболевания остановились на амплификации генов контактина (CTTN) и циклина D1 (CCND1), картированных на 11 хромосоме. Авторы провели сравнение данного генетического нарушения в опухолевой ткани больных раком гортани и глотки, а также у пациентов с гипер- и диспластическими изменениями эпителия указанных локализаций. Было показано, что обнаруженная амплификация ассоциировала с клинико-морфологическими параметрами и исходом заболевания. Так, в случае с геном CTTN амплификация выступала в качестве независимого фактора прогноза безрецидивной выживаемости у больных на поздней стадии заболевания, с условием локализации опухолевого процесса в гортани, тогда как на расположенную в глотке опухоль этот феномен не распространялся, свидетельствуя, вероятно, об органоспецифичности данного генетического изменения. Амплификация второго гена, CCND1, была отмечена, наоборот, на ранней стадии канцерогенеза, при этом уровень экспрессии гена был увеличен у больных с умеренной степенью диспластического процесса. Однако изменение уровня экспрессии гена CTTN было характерно исключительно для дисплазии тяжелой степени, прогрессирующей в инвазивную карциному. Авторы, таким образом, предлагают использовать данный показатель в качестве биомаркера высокого риска рециди-вирования РГ и его неблагоприятного исхода. Согласно полученным данным они предлагают использовать изменение уровня экспрессии гена CTTN в качестве биомаркера высокого риска рецидивирования РГ и его неблагоприятного исхода.

С целью поиска маркеров риска развития РГ проводится анализ потери гетерозиготности (ПГ) генов-регуляторов клеточного цикла и онкосупрессоров, делеция которых может инициировать процесс малигнизации. Группой ученых из Египта показано, что ПГ такими сайтами. как 3р, 3q, 5q12-23, 8p22-p238q, 11q13, в два раза чаще встречается у больных с развившимся злокачественным процессом, по сравнению с пациентами, опухоль которых носит доброкачественный характер [11]. Ученые из США зарегистрировали явление потери гетерозигот- ности на 9, 18, 11 и 3-й хромосомах у больных с предопухолевыми заболеваниями гортани в 28, 10, 7 и 5 % случаев, соответственно, в то время как у больных с инвазивной карциномой гортани данное структурное нарушение генома было отмечено в большем проценте случаев – 72, 53, 47 и 35 % соответственно [22]. Кроме того, у больных раком гортани показана ассоциация ПГ с более распространенным опухолевым процессом и низкой степенью дифференцировки опухоли, т.е. с неблагоприятным прогнозом. Однако, несмотря на спектр изученных хромосом, в качестве маркера прогрессии заболевания авторы рекомендуют остановить свой выбор на потере гетерозиготности короткого (р) плеча 8 и 9 хромосомами [22]. Корейские коллеги по результатам своих исследований сделали заключение, согласно которому потеря геторози-готности р21 сайта на 9 хромосоме достаточно широко распространена при метаплазии и дисплазии, а также в случаях инвазивной и метастатической карциномы гортани. Полученные результаты могут быть рассмотрены в качестве рекомендации для применения изученной ПГ в качестве маркера высокого риска прогрессии заболевания. В то же время ПГ региона р21.3-р22 на хромосоме 8 встречается преимущественно в инвазивных опухолях, не представляя собой прогностической ценности [58].

Кроме того, в качестве кандидатного маркера прогрессии доброкачественной опухоли гортани рассматривается явление микросателлитной нестабильности (МН), регистрируемое в 4–6 % случаев гиперплазии без атипии, в 11–17 % – легкой, в 10–26 % – умеренной и в 27 % случаев – высокой степени дисплазии и карциномы in situ, а также в 33–39 % – при развитии рака гортани. Однако вопрос о том, насколько подобные изменения генома специфичны для данной локализации и оправдано ли их использование в качестве маркеров риска, остается открытым [27, 28].

Важными в онкологии, в частности при изучении рака гортани, являются исследования, направленные на поиск маркеров, предсказывающих способность опухоли к инвазии и метастазированию, т.е. позволяющие с высокой точностью прогнозировать течение и исход заболевания. Подобные работы проводятся во всем мире, число их с каждым годом растет, получены определенные результаты, однако и спектр изучаемых маркеров также увеличивается, что еще более затрудняет работу в этом направлении. На сегодняшний день не существует общепризнанного молекулярно-биологического маркера, позволяющего с высокой долей вероятности прогнозировать инвазию и метастазирование опухоли у больных РГ, за исключением, возможно, тканевых металлопротеиназ, которые являются индикаторами инвазии опухоли. Согласно данным R.M. Germani et al. (2009) [26], уровень экспрессии матриксной металлопротеиназы мембранного типа 1 (MT1-MMP) может быть рассмотрен в качестве кандидатного маркера для идентификации агрессивного фенотипа первичной опухоли ротовой полости, а также микрометастазов и инвазии. Однако оценка уровня экспрессии матриксной металлопротеиназы 26 (MMP-26) в опухолевой ткани может выступать и в качестве молекулярного маркера на этапе ранней диагностики широкого спектра злокачественных опухолей (область головы и шеи, прямая кишка, молочная железа, простата), обладающих инвазивной потенцией [60]. Группа ученых из Китая, проведя метаанализ данных относительно ассоциации полиморфизма ма-триксных металлопротеиназ с риском развития рака области головы и шеи, показала наличие такового для MMP2-1306 (C>T), MMP2-735 (C>T) и MMP7-181 (A>G), тогда как полиморфизм MMP9-1562 (C>T) не выступал в качестве фактора риска. При этом авторы не делают окончательных выводов, оставляя за собой право дальнейшего детального изучения вопроса о возможности применения изученных маркеров в клинической практике [47]. Повышенную экс-перссию таких металлопротеиназ, как ММР-2 и -9, в опухолевой ткани по сравнению со здоровой отмечают многие ученые, что позволяет считать синтез данного фермента показателем злокачественности при плоскоклеточном раке области головы и шеи [16, 32, 40]. Е.В. Клишо с соавт. [3, 4] в своих исследованиях подтвердили результаты, полученные вышеперечисленными авторами, показав, что высокий уровень содержания ММР-9, но только в сыворотке крови является признаком плохого прогноза 2-летней выживаемости больных раком области головы и шеи.

Изучение уровня экспрессии NF-kB и митоген-активированной протеинкиназы в опухолевой и морфологически не измененной ткани больных злокачественными новообразованиями области головы и шеи показывает значительное повышение этого показателя в опухолевой ткани [12, 36, 37, 38, 55]. Кроме того, отмечена ассоциация уровня экспрессии изученных генов с целым рядом клинически значимых параметров, такими как лимфогенное метастазирование, стадия заболевания, а также общая выживаемость больных, у которых обнаружен данный феномен. Проведенный авторами регрессионный анализ подтвердил возможность использования повышенного уровня экспрессии NF-kB в качестве независимого фактора прогноза общей выживаемости больных раком гортани. В клинической онкологии достаточно широкое применение также нашла методика оценки уровня экспрессии генов ингибиторов циклин-зависимых киназ и циклинов, в частности А и Е, которые, по заключению ряда авторов, являются более информативными маркерами клеточной пролиферации, чем Ki-67 [41, 44, 18].

Среди больных раком области головы и шеи отмечается вариабельность и в уровне синтеза теломеразы и ингибитора циклин-зависимых киназ (р15(INK4b). Теломеразную активность и делецию генов ингибиторов киназ регистрируют в 70 и 80 % случаев соответственно, на поздних стадиях заболевания, при опухолях с низкой степенью дифференцировки, высокой пролиферативной активностью клеток и высоким уровнем анеуплоидии, что может быть использовано для прогноза течения заболевания и выбора адекватной тактики лечения [52].

В качестве критерия предсказания ответа на терапию препаратами платины у больных плоскоклеточным раком головы и шеи важным и наиболее часто используемым тестом выступает оценка уровня экспрессии белка Bcl-2, относящегося к семейству антиапоптотических белков. Продемонстрирована ассоциация высокого эндогенного уровня экспрессии Bcl-2 с повышенной резистентностью к цисплатину [42]. Группа ученых из штата Мичиган в качестве маркеров чувствительности к терапии и оценки выживаемости у больных РГ выбрала изучение уровня экспрессии рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), белка-ингибитора цикли-на D1 (р16), Bcl-xL и р53 [34]. Было показано, что низкий уровень синтеза EGFR и высокий р16 являлись индикаторами адекватного ответа на органосохранную терапию и благоприятного исхода заболевания. В то же время высокий уровень EGFR в комплексе с низким уровнем синтеза белка р53/или высоким Bcl-xL ассоциировал с неблагоприятным исходом заболевания.

Интересны и мало изучены с позиции маркеров прогноза и исхода злокачественных заболеваний респираторного тракта, в частности рака гортани, miRNA, представляющие собой эндогенную некодирующую РНК, состоящую из 18–25 нуклеотидов, принимающую участие в посттранскрипционной генной регуляции [19, 51, 59]. У человека, согласно литературным данным, количество miRNA может превышать тысячу [57]. Известно, что одна молекула miRNA может контролировать экспрессию сотни генов [57]. Примечательно, что более 50 % генов, кодирующих miRNA, расположены вблизи онкоассоциированных регионов генома, в так называемых ломких сайтах, что объясняет причастность этих молекул к патогенезу онкологических заболеваний [61]. Так, miRNA-15 и 16 индуцируют апоптоз, активируя Bcl-2. Молекула miRNA, входящая в состав кластера miRNA-1792, влияет на размер опухоли и выступает в роли онкогена под влиянием процесса трансляции mRNA Е2F1 [19]. Экспериментально показано, что инактивация miRNA коррелирует с основными клиническими параметрами (степень дифференцировки опухоли и исход заболевания), характеризующими злокачественные опухоли различной локализации. C. Ortholan et al. (2009) [36], изучив опухолевую ткань, полученную от больных раком легкого, обнаружили 45 аберрантно экспрессированных miRNA [46]. В эксперименте показана корреляция между экспрессией miRNA и эффектом, оказываемым этой молекулой на онкогены, канцерогенез и пролиферацию опухолевых клеток. Кластер miRNA (miR)-17-92, известен как онкоген, однако miRNA let-7 репрессирует ген Ras, а miR-15a/-16-1 – ген Bcl-2, проявляя себя в данном случае в качестве опухолевого супрессора. На основании полученных результатов авторы делают заключение, что miRNA, проявляющие свойства как онкогенов, так и опухолевых супрессоров, можно использовать в качестве маркера контроля за опухолевым процессом, а также модулятора при лечении злокачественной патологии. Известно также, что уровень экспрессии miRNA различается как в морфологически не измененной и опухолевой ткани, так и в опухолях различных локализаций, что может быть использовано для прогноза заболевания и предупреждения развития злокачественной опухоли. Таким образом, делают заключение авторы, miRNA является многообещающим и перспективным маркером диагностики и лечения рака [45].

Группой авторов во главе с G. Childs (2009) был изучен профиль экспрессии miRNA в нормальной и опухолевой ткани больных раком области головы и шеи. При этом установлено, что уровень экспрессии большинства молекул miRNA (miR-1, miR-133a, miR-205, let-7d) в первичном опухолевом очаге был снижен по сравнению с аналогичным показателем в нормальной ткани. Принимая во внимание, что, согласно литературным данным, в опухолях данной локализации наблюдается, как правило, сверхэкспрессия miRNA (например, hsa-miR-21), установленный факт показался авторам необычным [13, 30]. Для объяснения этого феномена были проведены ин- и мультивариантный анализы, показавшие наличие значимой связи между низким уровнем экспрессии hsa-miR-21 и локорегионарным рецидивированием, независимой от тяжести заболевания и проведенного лечения. Кроме того, низкий уровень экспрессии hsa-miR-205 и hsa-let-7d у этих больных значимо ассоциировал с низкой выживаемостью [17].

Отмечено также, что уровень экспрессии miRNA изменяется при различных физиологических и патологических процессах. Аберрантная экспрессия miRNA связана с развитием таких патологических состояний, как врожденные дефекты развития, нервные, сердечно-сосудистые и онкологические заболевания [35]. J. Ross et al. [51] рассматривают молекулы miRNA с позиции противораковой генной терапии, которая с помощью антисмысловых молекул будет оказывать ингибирующий эффект на активность miRNA.

Несмотря на столь разные взгляды и способы применения miRNA, на изучение уровня экспрессии этих молекул возлагают большие надежды как в диагностике и прогнозе, так и в терапевтической стратегии злокачественных новообразований. Проведенный анализ литературы по поиску биомаркеров риска и прогноза рака гортани не позволяет сделать однозначных выводов относительно использования полученных данных в клинической практике. Одной из причин этого является отсутствие строго разработанных теоретических алгоритмов проведения скрининговых программ с точно установленным уровнем того или иного показателя, который может с высокой вероятностью свидетельствовать об инициации злокачественной патологии в организме. С помощью подобного показателя можно было не только обозначить четкую грань между предопухолевым заболеванием и опухолевым процессом, но и провести дифференциальную диагностику уже развившегося злокачественного заболевания. Поиск молекулярно-генетических маркеров канцерогенеза, обладающих клинической значимостью, должен четко соответствовать поставленным целям и задачам исследования и проводиться с учетом генетических особенностей организма, с привлечением пробандов обследуемого больного, поскольку гены предрасположенности к онкологической патологии могут передаваться по наследству. Предполагается, что новые, более информативные критерии ранней диагностики и прогнозирования течения РГ могут и должны разрабатываться на основе комплекса современных молекулярно-биологических, генетических, вирусологических методов исследования.