Молекулярно-генетический анализ популяций хвойных видов растений на Урале и востоке европейской части России для сохранения и возобновления лесных ресурсов

Пришнивская Яна Викторовна, инженер-исследователь

Юсупов Руслан Равильевич, студент сателлитного анализа (ISSR-Inter Simple Sequence Repeats). Метод основан на использовании ПЦР с одним или несколькими праймерами длиной 15-24 нуклеотида. Праймеры состоят из тандемных коротких 2-4 нуклеотидных повторов и одного селективного нуклеотида на 3'-конце праймера. В геномах растений количество микросателлитных повторов очень велико, что делает этот метод удобным для генетического анализа [3]. Несмотря на изученность многих аспектов популяционной биологии видов хвойных растений [4-6] генетические ресурсы многих лесообразующих видов хвойных России, включая популяции сосны обыкновенной и лиственницы сибирской, в том числе на Урале и в восточной части Европейской части России, остаются слабоизученными. Эффективность решения задач популяционной биологии многих видов зависит от изученности различных элементов генома и их полиморфизма.

Цель работы: получение качественно новой информации при оценке генетического разнообразия, генетической структуры и дифференциации популяций сосны обыкновенной и лиственницы сибирской с использованием меж-микросателлитного анализа полиморфизма ДНК.

Материал и методика исследования. Объектами исследований являются восемь популяций двух видов хвойных растений из семейства Pinaceae : сосны обыкновенной ( Pinus sylvestris L.) и лиственницы сибирской ( Larix sibirica Ledeb.). Две популяции P. sylvestris расположены в Республике Коми: около п. Морди-но (Ps_1) и около п. Визинга (Ps_2), а две – в Кировской области в Шабалинском лесничестве (Ps_3) и в Ежихинском лесничестве (Ps_4). Три изученные популяции L. sibirica расположены в Пермском крае: около п. Полазна (Ls_1), около г. Оса (Ls_2) и около г. Очер (Ls_4), а одна популяция L. sibirica – в Сверд-ловской области около п. Билимбай (Ls_3).

Выделение ДНК проводили по методике С. Роджерса [7], модифицированной использованием в качестве сорбента PVPP (polyvinylpolypyrrolidone). ДНК была выделена из свежих почек, собранных от каждого дерева индии-видуально. В каждой популяции изучено от 30 до 46 деревьев. Расстояние между деревьями не менее 50 м. Навеска растительного материала составляла 100 мг. Анализ полиморфизма ДНК проведен у 184 проб ДНК P. sylvestris и у 160 проб ДНК L. sibirica с пятью праймерами посредством ПЦР. Для изучения генетической изменчивости популяций P. sylvestris ампли-фицировано 920 проб ДНК, а у L. sibirica – 800 проб ДНК. Концентрацию и качество ДНК определяли на спектрофотометре «NanoDrop 2000» (Thermo Fisher Scientific, США) и выравнивали до 10 нг/мкл. Эффективность праймеров по выявлению полиморфизма ДНК рассчитывали в соответствии со шкалой 1–5: от низкой (1) до высокой (5) [8]. Каждый праймер индивидуально был анализирован в ПЦР с геномной ДНК исследуемых видов.

Для ПЦР ISSR-методом объемом 25 мкл мы использовали реакционную смесь следующего состава: 2 единицы Tag -полимеразы, 2,5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР, 25 пМ праймера , 2,5 мМ Mg²⁺, 0,25 мM dNTP, 5 мкл геномной ДНК. Амплификацию проводили в амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, США) по следующей программе: предварительная денатурация 94°C, 2 мин.; первые пять циклов 94°С, 20 сек.; t° отжига, 10 сек.; 72°С, 10 сек.; в последующих тридцати пяти циклах 94°С, 5 сек.; t^о отж., 5 сек.; 72°С, 5 сек. Последний цикл элонгации длился 2 мин при 72ºС. Температура отжига в зависимости от G/С-состава праймеров варьировала от 52° до 64°С. В качестве отрицательного (К-) контроля в реакционную смесь для проверки чистоты реактивов добавляли вместо ДНК 5 мкл деионизированной воды. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1,7% агарозном геле в

1х ТВЕ буфере. Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе Gel-Doc XR («Bio-Rad», США). Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы (100 bp +1.5 + 3 Кb DNA Ladder) («ООО-СибЭнзим-М», Москва). Определение длин фрагментов проводилось с использованием программы Quantity One в системе гель-документации Gel-Doc XR («Bio-Rad», USA).

Компьютерный анализ полученных данных [9] проведен с помощью программы POPGENE1.31 и с помощью специализированного макроса GenAlEx6 для MS-Excel с определением: доли полиморфных локусов ( P 95 ), абсолютного числа аллелей ( n a ), эффективного числа аллелей ( n e ), ожидаемой гетерозиготности ( H E ). Для описания генетической структуры популяции были использованы следующие параметры: ожидаемая доля гетерозиготных генотипов ( H T ) во всей популяции, как мера общего генного разнообразия; ожидаемая доля гетерозиготных генотипов ( H S ) в субпопуляции как мера ее внутрипопуляционного разнообразия; доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или показатель подразделенности популяций ( G ST ).

Экспериментальная часть и обсуждение результатов. Протестировано 20 и выявлено 5 наиболее эффективных ISSR-праймеров для каждого из двух исследуемых видов. Лишь два праймера (X10 и CR-215) оказались эффективными (5 баллов) для обоих изученных видов (табл. 1). Установлены по 3 специфических эффективных ISSR-праймера для сосны обыкновенной и для лиственницы сибирской. Для сосны обыкновенной эффективными являются 4 динуклеотидных праймера и один трехнуклеотидный (в зависимости от числа нуклеотидов в коровом повторе), а для лиственницы сибирской 2 эффективных праймера динуклеотидные, а 3 – тринуклеотидные (табл. 1). В изученных 4 популяциях P. sylvestris выявлены 117 ISSR-маркеров, а в 4 же популяциях L. sibirica – 126 ISSR-маркеров. Число амплифицированных ISSR-маркеров P. sylvestris варьировало в зависимости от праймера от 13 (праймер M27) до 21 (праймеры X10 и CR215) а их размеры – от 150 до 1400 пн. В среднем один ISSR-праймер инициировал у P. sylvestris синтез 16,7 фрагментов ДНК. В изученных же популяциях L. sibirica число ам-плифицированных ISSR-маркеров варьировало в зависимости от праймера в большей степени – от 11 (праймер M3, ISSR8) до 29 (праймер M9); диапазон длин ISSR-маркеров также шире – от 210 до 2240 пн. Один ISSR-праймер у L. sibirica инициировал синтез 17,1 фрагментов ДНК.

Таблица 1. Эффективность ISSR-праймеров для изучения генетического полиморфизма двух видов хвойных растений

ISSR-праймер		Эффективность праймера		ISSR-праймер		Эффективность праймера
		для P.sylvestris	для L.sibirica			для P.sylvestrisis	для L.sibirica
M1	(AC) 8 CG	2	3	ISSR-5	(AG) 8 CA	2	3
M2	(AC) 8 CC	4	1	ISSR-6	(AG) 8 CG	4	3
M3	(AC) 8 CT	3	5	ISSR-7	(CTC) 6 C	2	3
M27	(GA) 8 C	5	2	ISSR-8	(GAG) 6 C	3	5
M9	(GAC) 5 AC	2	5	ISSR-9	(ACG) 7 G	1	4
X10	(AGC) 6 C	5	5	ISSR-10	(ATG) 7 C	1	4
X11	(AGC) 6 G	3	4	CR-212	(CT) 8 TG	5	2
ISSR-1	(AC) 8 T	5	4	CR-215	(CA) 6 GT	5	5
ISSR-3	(TG) 8 AA	4	1	CR-216	(GA) 6 GG	3	4
ISSR-4	(TG) 8 GC	1	1	CR-217	(GT) 6 GG	1	3

Примечание: эффективность праймеров от 1 (низкая) до 5 (высокая) определена по шкале, предложенной Р.Н. Календарем и С.В. Боронниковой (2007).

Установлено, что доля полиморфных локусов ( P 95 ) высока в изученных популяциях обоих видов: 0,949 у P. sylvestris и 0,968 у L. sibirica (табл. 2). Число полиморфных маркеров в общей выборке P. sylvestris варьировало от 19 до 28, а доля полиморфных локусов ( P 95 ) в зависимости от ISSR-праймера колебалась от 0,880 до 1,000. Число полиморфных маркеров полиморфизма в общей выборке второго изученного вида растений L. sibirica изменялось от 21 до 35, а доля полиморфных локусов ( P 95 ) в зависимости от ISSR-праймера варьировала от 0,917 до 1,000. Ожидаемая гетерозиготность ( Н Е ) по локусам (один из основных показателей генетического разнообразия на популяционном уровне) выше (табл.

• 2)    в общей выборке L. sibirica ( Н Е =0,171) по сравнению с P.sylvestris ( Н Е =0,138). Ожидаемая гетерозиготность выше в первой популяции P. sylvestris ( Н Е =0,186) и ниже в третьей популяции Н Е =0,088). Этот показатель самый высокий в четвертой популяции L.sibirica ( Н Е =0,194) и самый низкий во второй популяции L. sibirica ( Н Е =0,130). Эффективное число аллелей ( n e ) оценивает величину, обратную гомозиготности, и представляет собой такое число аллелей, при одинаковой частоте которых в популяции ожидаемая гетерозиготность будет равна фактической [10]. Этот показатель выше (табл. 3) в общей выборке P. sylvestris ( n e =1,549) по сравнению с L. sibirica ( n e =1,421).

Таблица 2. Генетическое разнообразие популяций P. sylvestris и L. sibirica

Показа за-тели	Ps_1	Ps_2	Ps_3	Ps_4	На общую выборку P. sylvestris	Ls_1	Ls_2	Ls_3	Ls_4	На общую выборку L. si-birica
Р 95	0,739	0,827	0,442	0,500	0,949	0,909	0,678	0,769	0,876	0,968
НЕ	0,186	0,183	0,088	0,093	0,138	0,172	0,130	0,190	0,194	0,171
	(0,018)	(0,018)	(0,014)	(0,015)	(0,016)	(0,017)	(0,015)	(0,017)	(0,017)	(0,017)
na	1,556	1,539	1,299	1,325	1,949	1,556	1,452	1,556	1,619	1,968
	(0,499)	(0,501)	(0,460)	(0,470)	(0,222)	(0,499)	(0,499)	(0,499)	(0,488)	(0,176)
ne	1,312	1,308	1,143	1,152	1,549	1,286	1,211	1,315	1,319	1,421
	(0,360)	(0,359)	(0,278)	(0,287)	(0,351)	(0,351)	(0,313)	(0,348)	(0,346)	(0,302)
R	7	3	2	4	16	5	7	4	4	20

Примечание: H _E – ожидаемая гетерозиготность; n _a – абсолютное число аллелей на локус; n _e – эффективное число аллелей на локус; у всех вышеуказанных параметров в скобках даны стандартные отклонения; R – число редких маркеров, в скобках указана их доля от общего числа фрагментов; популяции P. sylvestris : Ps_1, Ps_2, Ps_3, Ps_4 ; популяции L.sibirica : Ls_1, Ls_2, Ls_3, Ls_4.

Анализ генетической структуры изученных популяций P. sylvestris показал, что ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в общей популяции ( H T ) составила 0,317, а в субпопуляциях ( H s ) – 0,137. Коэффициент подразделенности популяций P.sylvestris ( G ST ) равен 0,567

(табл. 3). У изученных популяций L. sibirica показатели, характеризующие генетическую структуру ниже. Так, H T =0,287, а H s составил 0,171. Следовательно, и коэффициент подразделенности популяций L. sibirica меньше ( G ST =0,403).

Таблица 3. Генетическая структура и дифференциация изученных популяций P. sylvestris и L.Sibirica

ISSR-праймер	Нуклеотидная последовательность (5'→ 3')	H T	H s	G ST	ISSR-праймер	Нуклеотидная последовательность (5'→ 3')	H T	H s	G ST
X10	(AGC) 6 C	0,325 (0,024)	0,127 (0,008)	0,565	X10	(AGC) 6 C	0,297 (0,030)	0,100 (0,006)	0,663
CR-215	(CA) 6 GT	0,325 (0,026)	0,172 (0,009)	0,472	CR-215	(CA) 6 GT	0,259 (0,034)	0,176 (0,015)	0,319
M27	(GA) 8 C	0,295 (0,034)	0,124 (0,007)	0,579	М3	(AC) 8 CT	0,308 (0,020)	0,211 (0,015)	0,314
ISSR-1	(АС) 8 T	0,356 (0,028)	0,143 (0,014)	0,600	ISSR-8	(GAG) 6 C	0,338 (0,023)	0,146 (0,011)	0,567
CR-212	(CT) 8 TG	0,290 (0,031)	0,126 (0,012)		М9	(GAC) 5 AC	0,255 (0,020)	0,206 (0,012)	0,191
На общую выборку		0.317	0.137	0,567	На общую выборку		0,287	0,171	0,403
P. sylvestris		(0.028)	(0.010)		L.sibirica		(0,025)	(0,013)

Примечание: H _T – ожидаемая доля гетерозиготных генотипов как мера общего генного разнообразия во всей популяции; H _s – ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в субпопуляции, как мера ее внутрипопуляционно-го разнообразия или среднее выборочное генное разнообразие по всем локусам; G _ST – доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или показатель подразделенности популяций; в скобках даны стандартные отклонения

Для характеристики генетической структуры популяций важны редкие, то есть встречающиеся с частотой менее 5% маркеры. В изученных популяциях P. sylvestris выявлено 16 редких ISSR-маркеров, из которых наибольшее число ( R =7) отмечено в популяции Ps_1, а наименьшее ( R =2) в популяции Ps_3. В изученных популяциях L. sibirica выявлено 20 редких ISSR-маркеров, при этом их число варьировало в зависимости от популяции от 4 до 7 (табл. 2).

Выводы и рекомендации: для Pinus sylvestris L. и Larix sibirica Ledeb. установлены эффективные ISSR-праймеры для выявления генетического полиморфизма. В 4 изученных популяциях P. sylvestris выявлены 117 ISSR-маркеров, а в 4 изученных популяциях L. sibirica – 126 ISSR-маркеров. Доля полиморфных локусов ( Р 95 ) высока в изученных популяциях обоих видов: 0,949 у P. sylvestris и 0,968 у L. sibirica . Ожидаемая гетерозиготность изученных популяций лиственницы сибирской составила 0,171, а сосны обыкновенной – 0,138. Анализ генетической структуры изученных популяций показал, что популяции P. sylvestris дифференцированы в большей степени ( G ST =0,567), чем популяции L.sibirica ( G ST =0,403).

Для сохранения и возобновления лесных ресурсов с учетом генетического разнообразия для P. sylvestris рекомендуется использовать две популяции из республики Коми (Ps_1 Ps_2 ) , а для L. sibirica – одну популяцию из центральной части Пермского края около п.Полазна (Ls_1). При отборе деревьев для лесовосстановления необходимо учитывать генетическую структуру природных популяций, устойчивое сочетание гомозиготных и гетерозиготных генотипов, а также наличие редких ISSR-маркеров, которые наряду с другими маркерами могут быть использованы и для идентификации популяций, в том числе для генетического контроля происхождения древесины [10, 11].

Работа выполнена при финансовой поддержке задания 2014/153 государственных работ в сфере научной деятельности в рамках базовой части государственного задания Минобрнауки России и гранта РФФИ (проект № 12- 04-00062-а).