Молекулярно-генетический анализ сортообразцов озимой пшеницы, выращенных в различных экологических зонах Украины

Проблема качества зерна является одной из важнейших при создании новых сортов озимой мягкой пшеницы. При этом экологическая составляющая выращивания растений и, в целом, климатические особенности определенных регионов оказывают существенное влияние на качество и количество растительной продукции. Наряду с экологическими аспектами природопользования, которые должны учитываться в растениеводстве, особого внимания заслуживает и генетическая составляющая сортов, во многом определяющая пищевую ценность пшеничной муки [1]. Существует достаточно большое количество генетических систем, QGpc-локусов, контролирующих качество зерна пшеницы [2, 3]. Среди них важное место по эффективности занимают QTL и генные структуры, определяющие состав высокомолекулярных субъединиц глютенинов (HMW-GS).

В настоящее время продолжается идентификация локусов, ответственных за HMW-GS у пшеницы [4, 5]. Гены, которые контролируют высокомолекулярные глютенины, находятся в проксимальных участках на длинном плече хромосом 1А, 1В, 1D пшеницы и характеризуются множественным аллелизмом [6].

Классификация мирового генофонда по аллельным вариантам высокомолекулярных глютенинов позволила охарактеризовать частоту распространения отдельных субъединиц, составляющих аллельные варианты локусов Glu-A1, Glu-B1, Glu-D1 среди 1060 сортообразцов озимой мягкой пшеницы разных стран мира.

В Украине у изученных образцов преобладал вариант Glu-В1 7+9 (частота встречаемости 65,8%), в то время как к первой категории субъединиц, которые имеют генотипически обусловленное позитивное влияние на технологические и биохимические свойства зерна, необходимо отнести 1В 7+8,

частота которой среди украинских сортов составляла примерно 21,8% [7, 8]. При ПЦР-анализе 28 сортов пшеницы из 11 стран мира также была зафиксирована большая частота субъединиц глютенина 7+9, чем высокоэффективных HMW-GS 7+8 [5]. Это свидетельствует об определенной уникальности субъединиц глютенина, которые определяют высокое качество теста.

В последние годы особое внимание исследователей, работающих в области экологических аспектов селекции, а также генетических проблем качества зерна пшеницы, привлечено к изучению аллеля Glu-B1 al , который обеспечивает наилучшие показатели хлебопекарного качества муки. Было показано, что ‘ x’ –тип гена локуса Glu-B1 al кодирует субъединицу 1Bx7^OE, обусловливает её сверх экспрессию и является одним из наиболее сильных по позитивному влиянию на качество муки пшеницы среди идентифицированных Gli/Glu аллелей в мировой коллекции. Впервые он был выявлен у сорта мексиканской пшеницы Ред Ривер 68, который характеризуется высокими показателями качества муки, и по молекулярному строению представляет собой тандемную дупликацию ДНК, кодирующую биосинтез субъединицы 1Bx7 глютенина [9]. В настоящее время показано, что среди сортов озимой мягкой пшеницы, занесенных в Государственный реестр сортов растений, пригодных для распространения в Украине, 6 сортов являются носителями аллеля Glu-B1 al [10].

Все генотипы, которые несут аллель Glu-B1 al , могут быть идентифицированы биохимическими методами, а также с помощью молекулярногенетических методов по наличию инсерции в 43 п.н. в регионе MAR (matrix-attachment region) и дупликации в 18 п.н. в кодирующей области гена. Хотя, как было показано [11], последняя не является абсолютно специфичной, поскольку она была выявлена в первичной структуре ДНК других аллелей ( Glu-B1 ak , Glu-B1 b ), среди растений сорта Chinese Spring, изолятов тетраплоидной пшеницы и других материалов.

В Институте физиологии растений и генетики Национальной академии наук Украины проводится большая работа по созданию высокопродуктивных, сверхсильных по качеству сортов озимой мягкой пшеницы [12] и использование молекулярногенетических технологий является важной составляющей в генетико-селекционных программах. В данной работе представлены результаты идентификации аллеля Glu-B1 al в сортообразцах озимой пшеницы, выращенных в различных экологических зонах Украины.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Материалом исследований служили семена сор-тообразцов (398 номеров) озимой мягкой пшеницы, выращенные в зонах Лесостепи и Степи Украины, а также сортообразец пшеницы двуручки Древлянка и сорт Панна селекции Одесского селекционногенетического института Украинской академии аграрных наук, используемые в качестве положительного контроля при постановке полимеразной цепной реакции.

Суммарную ДНК выделяли из шрота, используя СТАВ-буфер, который обеспечивал качественный перевод ДНК в раствор с минимальными потерями. Очистка от белковой фракции достигалась двукратной экстракцией смесью хлороформ: изоамиловый спирт (24:1) с дальнейшим забором водной фазы. ДНК осаждали СТАВ-раствором 1ч. Освобождения от фракции РНК достигали путем добавления к раствору 50 мкг RNase A, инкубированием при 37°С /15мин, экстракцией смесью хлороформа и изоамилового спирта и, в итоге, осаждением высокомолекулярных нуклеиновых кислот изопропанолом. Осадок растительной ДНК промывали 70% этанолом, подсушивали и растворяли в ТЕ буфере pH 8,0, который обеспечивал оптимальные условия хранения очищенного препарата.

В качестве внутреннего контроля для ПЦР использовали праймеры к гену актина act (Gen Bank: AB181991.1). Для реакции брали 30 нг очищенной общей ДНК. Режим амплификации: первичная денатурация – 94°С/3мин и 35 циклов в режиме 94°С/30с; 57°С/30с; 72°С/39с; конечная элонгация 72°С/10мин. Продукты амплификации разделяли методом электрофореза в 1,2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия и документировали на рабочей станции Gel-Doc (BioRad).

Для мультплексной ПЦР с целью выявления ин-серции в 43 п.н. в регионе MAR использовали праймеры MAR-F 5'-CCTCA GCATG CAAAC ATGCA GC-3' и MAR-R 5'-CTGAA ACCTT TGGCC AGTCA TGTC-3' [11] и праймеры к референтному гену пшеницы TaTM20 [13], размер ожидаемого ампликона 563 п.н и 934 п.н. Для реакции брали 30 нг ДНК. Режим амплификации: денатура- ция – 94°С/3мин и 40 циклов в режиме 94°С/30с; 61°С/30с; 72°С/1мин; конечная элонгация – 72°С/5мин. Продукты амплификации визуализировали после их электрофоретического разделения в 1,6% агарозном геле в ультрафиолетовом свете с использованием бромистого этидия как красителя.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Одним из первых этапов молекулярногенетического анализа ДНК является подтверждение наличия высокомолекулярных фракций во всех изучаемых образцах. Эти исследования были проведены и таким образом подтверждена возможность использования выделенного генетического материала для дальнейшей работы. Последующее определение качества ДНК с использованием праймеров к гену актина ( act ) показало, что все исследуемые образцы содержат ампликон длиной 507 п.н. (рис. 1) и выделенная ДНК из растений пшеницы достаточного качества для проведения основной полимеразной цепной реакции.

Результаты молекулярного скрининга образцов на наличие инсерции, характерной для аллеля al локуса Glu-B1 , выращенных в лесостепной (рис. 2а), либо степной (рис. 2б) зонах Украины, свидетельствовали об отсутствии у них различий.

Известно, что климатические особенности региона, экологические условия выращивания пшеницы оказывают влияние на показатели качества зерна. Однако наличие у определенных образцов генетически обусловленного локуса высокого качества зерна (Glu-B1 а1) позволило нам идентифицировать его независимо от зоны выращивания пшеницы. Представленная на рис. 2 часть общих результатов молекулярно-генетического анализа свидетельствует о том, что ампликон 563 п.н. присутствует практически у всех сортообразцов, включая сорт Панна, который относится к сильным пшеницам. Этот сорт пшеницы является носителем ин-серции в 43 п.н. в регионе MAR и, соответственно, гена Вх7OE [10]. Исключение составлял образец № 102, который по данным проведенного ПЦР-анализа содержит ампликон 520 п.н., выявляющий ген Вх7 [11].

Типичные результаты ПЦР-анализа на наличие локуса Glu-B1 а1 в проанализированном нами селекционном материале, полученном путем простых межсортовых, трёхлинейных, беккросных скрещиваний представлены на рис. 3. Они свидетельствуют о дифференциации селекционного материала по изучаемому гену. Присутствие в сортообразцах обоих ампликонов (520 та 563 п.н.) может быть индикатором их гетерогенности [11].

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

507 п.н.

500 п.н.

Рис. 1 . Электрофореграмма продуктов амплификации гена act в образцах пшеницы: 1 – 41923; 2 – 289; 3 – 103; 4 – 102; 5, 6 – негативный контроль, ДНК ячменя сорта Вакула; 7-9 - негативный контроль, ДНК рапса; 10, 11 – негативный контроль – ТЕ буфер; 12 – маркер молекулярного веса Gene Ruler™ DNA Ladder Mix (Thermo Scientific)

б

а

563 П.Н,

520 пл.

Рис. 2. Результаты идентификации аллеля Glu-B1al : а) 1 – маркер Gene Ruler™ DNA Ladder Mix; 2 – негативный контроль – ТЕ буфер; 3 – позитивный контроль – Панна; 4 – 107; 5 – 106; 6 –105; 7 – 104; 8 – 101; 9 – 4192; 10 – 289; 11 – 103; 12 – 102; б) 1 – 102; 2 – 103; 3 – 289;. 4 – 4192; 5 – 101; 6 – 104; 7 – 105; 8 – 106; 9 – 107; 10 – позитивный контроль – Панна; 11 – негативный контроль – ТЕ буфер; 12 – маркер молекулярного веса Gene Ruler™ DNA Ladder Mix

1   2 3   4    5 б 7   8   9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

934 п.н.

563 п.н.

520 п.н.

564 ц.н.

Рис. 3 . Результаты идентификации аллеля Glu-B1al : 1, 3, 5 - селекционные образцы, позитивные по аллелю Glu-B1al ; 4, 6-11, 13, 14 - селекционные образцы, негативные по аллелю Glu-B1al ; 2, 12 - селекционные образцы гетерозиготные по аллелю Glu-B1al ; 15 - позитивный контроль, Панна; 16 - негативный контроль, Древлянка; 17 - негативный контроль – ТЕ буфер; 18 –маркер молекулярного веса Lambda DNA/HindIII

В целом, анализ 398 селекционных образцов на наличие инсерции в 43 п.н. в регионе MAR свидетельствует о том, что 158 образцов (40%) являются позитивными по аллелю Glu-B1al, 196 образцов (49%) – негативными и 44 (11%) – гетерозиготными по идентифицируемому гену.

Следует отметить, что проблема повышения качества пшеничной муки приобретает определенную остроту, особенно в связи с увеличением Украиной экспорта зерна. В этой связи становится актуальным и необходимым использование в селекционных программах исходного материала с генетически обусловленными аллелями высокого качества зерна. Проведенный нами молекулярно- генетический анализ на наличие в селекционном материале озимой пшеницы аллеля Glu-B1а1 высокомолекулярных глютенинов свидетельствует о том, что выбранные методы исследования являются эффективными. Основываясь на результатах массового анализа по идентификации инсерции в 43 п.н. в регионе MAR, возможно дифференцировать вновь созданные с помощью различных методов гибридизации образцы и отбирать для дальнейшей работы генотипы, несущие ген Вх7 OE HMW-GS.