Молекулярно-генетический анализ верховки обыкновенной - Leucaspius delineatus (Heckel, 1843) из водоемов Республики Коми

Верховка обыкновенная (Leucaspius delinea-tus (Heckel, 1843) относится к непромысловым рыбам семейства карповых и характеризуется невысокими линейно-весовыми параметрами. В ее аре- ал на территории России входят все реки, впадающие с юга в Балтику и некоторые озера бассейна р. Онега. В бассейнах Каспия – Волга, реки Дагестана до Кумы, Черного моря и Азова – Дон, Кубань и реки черноморского побережья [1]. В Республике Коми (РК) верховка до недавнего времени была отмечена лишь в некоторых водоемах рек Вычегда (оз. Синдорское, являющееся остатком большого приледникового водоема, существовавшего в период четвертичных оледенений на европейском Северо-Востоке) [2] и Кама (реки Летка и Кобра) [3]. Из-за её ограниченного распространения Л.С. Берг предположил, что этот вид относительно недавно проник в Северодвинский бассейн по системе каналов, связывающих его с Волго-Камским бассейном. В последующем вид был отмечен в некоторых малых реках (притоках 1 и 2 порядков), а также озерах-старицах верхнего и среднего течения р. Вычегда [4]. Недавние находки верховки в некоторых водоемах и водотоках среднего течения р. Печора позволяют расширить ее ареал на северо-восток (рис. 1) [5].

Известно, что естественным барьером для распространения данного вида рыб на азиатскую часть территории России являются Уральские горы. Однако с развитием сети рыбоводных хозяйств стал возможен инвазийный механизм расселения. В научной литературе есть сведения о непреднамеренной интродукции верховки с последующим ее саморасселением в различных водоемах Сибири [6–10]. На территории Печорской ГРЭС (ПГРЭС), расположенной в среднем течении р.Печора, в 90-х гг. прошлого столетия также действовало тепловодное рыбоводное хозяйство. В результате интродукции в водоеме-охладителе электростанции (водохранилище наливного типа, созданное на базе двух естественных водоемов) образовались локальные самоподдерживающиеся группировки вер-ховки Leucaspius delineatus (Heckel, 1843), уклейки Alburnus alburnus (Linnaeus, 1758) и карпа Cyprinus carpio (Linnaeus, 1758). В то же время более широкая география находок верховки обыкновенной в Печорском районе, а также соответствие ряда счетных признаков (количество позвонков, поперечных рядов чешуй и чешуй в боковой линии) в выборках рыб бассейна р.Печора общей географической закономерности изменения этих показателей, свидетельствуют об ее длительном обитании в изучаемом районе [5].

Исходя из вышеизложенного, цель настоящего исследования – определить степень генетической дифференциации популяций верховки обыкновенной Leucaspius delineatus (Heckel, 1843) из водоемов республики для выявления механизма их заселения. Подобный подход позволяет существенно углубить зоогеографические исследования и расширить представления о путях формирования ихтиофауны бассейнов рек всего европейского Северо-Востока России.

Материал и методы

Для оценки генетической дифференциации популяций верховки был проведен филогенетический анализ с использованием определения последовательности (секвенирования) участка митохондриального гена субъединицы 1 цитохромоксидазы (COI мтДНК) и анализа полиморфизма длин ам-плифицированных фрагментов ДНК (AFLP – Amp- lified Fragment Length Polymorphism). Проанализированы две выборки из среднего течения р. Печора: по 15 образцов мышечной ткани рыб из водоема-охладителя ПГРЭС (географические координаты: N065°06'58.5, E057° 21'13.0) и находящегося на удалении 15 км от озера в пойме р. Печора (географические координаты N065°07'57.6, E057°04'15). Из среднего течения р.Вычегда исследовано шесть образцов, пойманных в водохранилище (географические координаты: N061°23'41.5, E050°45'16.2) у пос. Нювчим, образованном на месте слияния рек Нювчим и Дендель – притоков второго порядка р. Вычегда (рис. 1). Расстояния между популяциями для матрицы географических дистанций были измерены по «дуге большого круга» по географическим координатам.

Тотальная ДНК была выделена с помощью набора FastDNA Spin Kit (QBioGene) согласно инструкциям производителя. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированного участка мтДНК выполнено на генетическом анализаторе ABI PRISM 310 (Applied Biosystems) с использованием праймеров Fish F1: 5'-TCAACCAACCACAAA GACATTGGCAC-3' и Fish R2: 5'-TAGACTTCTGGG TGGCCAAAGAATCA-3' [11]. Выравнивание и анализ нуклеотидных последовательностей проводили в пакете программ MEGA 6.0. [12].

В AFLP анализе использовали рестриктазы EcoRI и MseI вместе с последовательностями адаптеров EcoRI и MseI. Смесь для реакции рестрикции-лигирования включала (на 10 реакций): 10 мкл T4 DNA Ligase buffer, 10 мкл NaCl (0,5 М), 5 мкл BSA (1 мг/мл), 10 мкл MseI adaptor, 10 мкл EcoRI adaptor и 10 мкл Enzyme Master Mix (на 10 реакций), состоящий из 1 мкл 10X T4 DNA Ligase buffer, 1 мкл NaCl (0,5 М), 5 мкл рестриктазы EcoRI, 1 мкл рестрикта-зы MseI, 0,5 мкл BSA (1 мг/мл), 0,5 мкл T4 DNA Ligase, 1 мкл воды без нуклеаз. Затем к 5,5 мкл смеси для реакции рестрикции-лигирования добавляли 5,5 мкл раствора ДНК (0,1 мкг/мкл) и инкубировали в течение 3 час при 37 ºС. После этого проводили преселективную амплификацию (преамплификация) с продуктом реакции рестрикции-лигирования, предварительно разбавленным в пять раз буфером ТЕ (20 ммоль TrisHCL, 0,1 ммоль EDTA, pH 8,0). Смесь для преселективной ПЦР включала: 2 мкл разбавленного продукта реакции рестрикции-лигирования, 0.5 мкл AFLP преселексив-ной пары праймеров (Applied Biosystems) и 7.5 мкл AFLP Core Mix (Applied Biosystems). Условия реакции преамплификации: 72ºС – 2 мин, 30 циклов (94 ºС -20 с, 56 ºС – 30 с, 72 ºС – 2 мин) и 60 ºС – 30 мин.

Затем проводили селективную амплификацию с продуктом реакции преамплификации, предварительно разбавленным в пять раз буфером ТЕ. Для реакции селективной амплификации были использованы три комбинации праймеров: EcoRI-AAG (меченый)/MseI-CAA, EcoRI-AGG (меченый) /MseI-CAT и EcoRI-ACG (меченый)/MseI-CTT. Смесь для селективной ПЦР включала: 1.5 мкл разбавленного продукта преселективной амплификации, 0.5 мкл EcoRI флуоресцентно меченого праймера, содержащего на своем конце три селективных нуклеотида (Applied Biosystems), 0.5 мкл MseI прайме-

озеро Синдор-

– малые реки и

– водохранилище

– ское (Зверева и др., 1955), водоемы поймы, а также водоем-охладитель Печорской ГРЭС (Бознак, Захаров, 2009),

Рис. 1. Сведения о находках верховки обыкновенной Leucaspius delineatus (Heckel, 1843) в водоемах Республики Коми из опубликованных литературных источников.

реки Летка и Кобра (Берг, 1949),

у пос. Нювчим (Рафиков, 2012).

На выносках стрелками обозначены во доемы, в которых были выловлены исследованные образцы верховки.

ра (Applied Biosystems) и 7.5 мкл AFLP Core Mix (Applied Biosystems). Условия реакции селективной амплификации были следующими: 94 ºС – 2 мин, 10 циклов (94 ºС – 20 с, 66 ºС (-1 ºС/цикл) – 30 с, 72 ºС – 2 мин), 20 (94 ºС – 20 с, 56 ºС – 30 с, 72 ºС – 2 мин) и 60 ºС – 30 мин. Далее проводили денатурацию продукта селективной амплификации с использованием формамида (Applied Biosystems) в течение 5 мин при 95 ºС. Реакционная смесь содержала 9,25 мкл формамида, 0,25 мкл стандарта GeneScan ROX 500 (Applied Biosystems) и 0,5 мкл продукта реакции селективной амплификации. Затем полученные образцы анализировали на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500 (Applied Biosystems). Полученные хроматограммы были обработаны с использованием внутреннего стандарта в программе GeneMapper 5.0 (Applied Biosystems) для установления длин полученных фрагментов. Затем фрагменты, различающиеся по длине менее чем на одну пару нуклеотидов (п. н.), были объединены вручную. В анализ включены фрагменты размером от 50 до 500 п. н. Наличие или отсутствие фрагментов кодировалось как «1» или «0», соответственно.

Статистический анализ данных AFLP проводили с использованием иерархической кластеризации методом Уорда на основе матрицы сходства, рассчитанной с использованием коэффициента Жаккарда в программной среде R [13]. В ней проверяли и статистическую значимость гипотезы «Iso-lation by distance» с использованием теста Мантела [14] для оценки корреляции между матрицами генетических и географических дистанций.

Кластеризацию на основе модели, описанной в работе [15], выполняли с помощью программы STRUCTURE v. 2.34 [15]. В качестве исходных данных использована бинарная матрица, содержащая сведения о 318 AFLP локусах 36 образцов верховки обыкновенной. В настройках программы было указано: не использовать данные о географическом происхождении образцов; применить «Admixture model» (модель, допускающую обмен генетической информацией между кластерами); количество итераций – 100 тыс. С такими настройками программа запускалась по 35 раз для каждого априорного значения числа кластеров (K) в диапазоне от 1 до 9. Остальные настройки были указаны в соответствии с рекомендациями авторов программы STRUCTURE для анализа доминантных маркеров [16]. Наиболее вероятное значение K (число генетически однородных кластеров) определяли методом, предложенным в работе [17]. Для численной оценки однородности результатов, полученных при независимых запусках STRUCTURE, использовали программу CLUMPP [18]. Визуализацию результатов расчета проводили с помощью программы DISTRUCT [19]. Молекулярногенетическое исследование образцов верховки выполнено на базе ЦКП «Молекулярная биология» Института биологии Коми НЦ УрО РАН (г. Сыктывкар).

Результаты исследований

В основе популяционных исследований живых организмов с помощью методов молекулярной биологии лежит выявление степени полиморфизма отдельных групп. В пределах ранга вида наиболее информативными являются рестрикционный анализ нуклеотидной последовательности ядерной ДНК и секвенирование отдельных генов мтДНК. Известно, что «не кодирующая» часть ядерного генома, ввиду меньшего селективного ограничения, более изменчива и ее скорость мутирования в два раза выше по сравнению с кодирующей [20]. Это увеличивает уровень выявляемого полиморфизма, а соответственно разрешающую способность метода и воспроизводимость полученных результатов.

Полученные последовательности участка мтДНК, кодирующего ген субъединицы 1 фермента цитохром оксидазы (COI) всех исследуемых образцов, зарегистрированы в базе данных GenBank национального центра биотехнологической информации США (KP 794941 – KP794948) [21]. Анализ указанных последовательностей выявил абсолютную идентичность их нуклеотидного состава (рис. 2). Отсутствие изменчивости данного гена в популяциях верховки обыкновенной из разных речных бассейнов республики, может указывать на быстрое расселение указанного вида. Учитывая высокую степень консервативности ген-кодирующей последовательности, расселение могло происходить несколько тысячелетий назад. По-видимому, в случае непреднамеренной интродукции (инвазийный механизм) с посадочным материалом на рыбоводное хозяйство ПГРЭС наблюдался бы некоторый нуклеотидный полиморфизм гена COI.

KP794947-Vichegda

KP794948-Vichegda

KP794946-Pechora

KP794945-Pechora

KP794944-Pechora

KP794943-Pechora

KP794942-Pechora

KP794941-Pechora

AP009307.1-France: Dombes near Leon

NC020357.1-France: Dombes near Leon

KJ.1-France: Rhone drainage

KJ 128525.1-Sweden

KJ 128524.1-Sweden

HQ961052.1-Czech Republic

HQ961053.1-Czech Republic

KJ553907.1-Turkey: Izmit drainage

I HQ961054.1-Czech Republic

HQ961055.1-Czech Republic

HQ961056.1-Czech Republic

—KJ552433.1-Alburnus alburnus France: Rhone drainage

0.0005

Рис. 2. Филогенетическое древо, построенное методом NJ (объединение ближайших соседей) на основании последовательностей COI мтДНК образцов Leucaspius delineatus (Heckel, 1843) и Alburnus al-burnus (Linnaeus, 1758) в качестве внешней группы.

При выполнении анализа длин квалифицированных фрагментов ДНК верховки три комбинации селективных праймеров позволили выявить 318 AFLP маркеров (локусов) длиной от 50 до 500 п.н. Определенные с помощью программы GenAlEx v. 6.501 популяционные показатели представлены в таблице. На основании анализа всех частот аллелей локусов AFLP 36 проанализированных образцов верховки обыкновенной из трех разноудален-

Результаты AFLP-анализа исследованных образцов, полученные с помощью программы GenAlEx v. 6.501

Место отбора Озеро пойменное Водоем-охладитель ПГРЭС Водохранилище Нювчимское № выборки 1 2 3 Координаты широта 65,132 65,115 61,391 долгота 57,072 57,353 50,765 % полиморфных локусов 36,16 82,08 53,14 Инф. индекс Шеннона 0,14±0,013 0,28±0,013 0,25±0,015 Число эффективных аллелей 1,15±0,016 1,28±0,019 1,26±0,018 Ожидаемая гетерозигот-ность смещенная (He) 0,09±0,009 0,17±0,010 0,16±0,010 несмещенная (uHe) 0,09±0,009 0,18±0,010 0,18±0,011 Генетическое расстояние Нея сравниваемые выборки 1-2 2-3 1-3 показатель 0,040 0,045 0,118 ных местообитаний была построена дендрограмма (рис. 3). При кластеризации выделилось несколько групп исследованных особей. Генетически наиболее дифференцируемыми оказались образцы из Нюв-чимского водохранилища (бассейн р. Вычегда) и озера в пойме р. Печора, географическое расстояние между которыми составляет около 520 км. Большая часть особей из водоема-охладителя ПГРЭС кластеризовалась совместно с таковыми из пойменного озера и несколько образцов вошли в вычегодскую

Рис. 4. Визуализация результатов анализа AFLP-маркеров Leucaspius delineatus (Heckel, 1843) из трех водоемов Республики Коми методом главных компонент. 1 – озеро пойменное (р. Печора), 2 – водоем-охладитель Печорской ГРЭС, 3 – водохранилище Нювчимское (р. Нювчим, бассейн р. Сысола).

кладу. Тем не менее, анализ главных компонент, проведенный с бинарными данными AFLP анализа в программной среде R, показал значимую обособленность исследуемых популяций (рис. 4).

Эти результаты были поддержаны анализом с применением методов байесовской статистики. С использованием алгоритма, описанного в работе [17], определили наиболее вероятное число генетических кластеров, равное 3. Это значит, что из проанализированных 36 образцов по данным AFLP анализа было выделено 3 ДНК-группы, обладающих генетическим своеобразием (рис. 5).

Результаты байесовского анализа в программе «STRUCTURE», основанного на составе AFLP-локусов, также свидетельствуют о высокой вероятности разделения исследованных рыб из пой-

Рис. 3. Дендрограмма сходства образцов Leucaspius delineatus (Heckel, 1843), построенная на основе данных AFLP анализа (матрица сходства рассчитана с использованием эвклидова расстояния, иерархическая кластеризация выполнена с использованием метода Уорда). Происхождение образцов: 1 – озеро пойменное (р. Печора), 2 – водоем-охладитель Печорской ГРЭС, 3 – водохранилище Нювчимское (р. Нювчим, бассейн р. Сысола).

Рис. 5. Результаты байесовского анализа с помощью программы «STRUCTURE v. 2.34» состава AFLP-локусов 36 образцов Leucaspius delineatus (Heckel, 1843) различного географического происхождения. Определение наиболее вероятного числа кластеров (K) по величине Δ K.

менного озера (р. Печора) и Нювчимского водохранилища (рис.6). Часть особей, отобранных из водоема-охладителя ПГРЭС (5 экз.), могут быть классифицированы как «вычегодские», остальные – как «печорские».

Удобной количественной характеристикой при сравнении популяций является величина генетического расстояния между ними. Чаще всего используют стандартное генетическое расстояние Нея [22]. Такое генетическое расстояние между проанализированными группами (Nei Distance) варьировало от 0,04 до 0,118. Дистанция между выборками из Печорского бассейна была наименьшей. Это объясняется незначительным физическим расстоянием и свидетельствует о более близкой связи между данными группировками. Степень иден-

Рис. 6. Результаты байесовского анализа с помощью программы «STRUCTURE v. 2.34» состава AFLP-локусов 36 образцов Leucaspius delineatus (Heckel, 1843) различного географического происхождения. Ось абсцисс - номера выборок и код их географического происхождения (1 – озеро пойменное (р. Печора), 2 – водоем-охладитель Печорской ГРЭС, 3 – водохранилище Нювчимское (р. Нювчим, бассейн р. Сысола). Ось ординат - вероятность (%) кластеризации исследуемых образцов на группы по составу AFLP-локусов. Для подготовки рисунка использована усредненная Q-матрица, полученная с помощью программы «CLUMPP v. 1.1.2».

тичности исследованных популяций из бассейнов рек Печора и Вычегда меньше, чем в пределах Печорского бассейна. Это свидетельствует о длительном отсутствии обмена генетической информацией между популяциями вследствие давней изоляции речных бассейнов.

Обсуждение результатов

Реки северного склона Русской равнины (Печора, Вычегда) на всем своем протяжении располагаются в области покрытия льдами максимального оледенения. На территории европейского Северо-Востока России расселение верховки могло происходить в период отступания льдов максимального оледенения. Участок среднего течения р. Печора в то время был представлен тремя крупными озерами (Троицко-Печорское, Лебяжское и Усинское). По существующим предположениям, до формирования Камо-Печоро-Вычегодских водоразделов часть стока этих озер была направлена в р. Кама (р. Вель – приток р. Печора рассматривается как верховье Пракамы). Верховье р.Печора, развивавшееся изолированно со времен доледниковья, в отдельные периоды также имело сток в Каму по долинам рек Нем, Вычегда и Северная Кельтма [23].

Интересным фактом является область распространения леща в бассейне р. Печора, большая часть которого приурочена к магистральному руслу и водоемам среднего и большей части нижнего течения реки. Лещ и верховка – единственные в р.Пе-чора представители понто-каспийского фаунистического комплекса (теплолюбивые виды рыб, адаптированные к жизни в реках Понто-Каспия). По данным Г.В.Никольского [24], в теплые фазы после-ледниковья представители этого комплекса могли иметь более широкое распространение в бассейне Северного Ледовитого океана, однако вследствие изменения условий численность их значительно сократилась.

В пользу гипотезы о длительном обитании верховки обыкновенной в водоемах бассейна р.Печора также свидетельствует и результат теста Мантела, оценивающего корреляцию между матрицами генетических и географических дистанций (999 повторов; коэффициент корреляции между матрицами – 0,5; p-value: 0,001). Необходимо отметить явную гетерогенность проанализированного материала. Рыбы из пойменного озера характеризуются минимальной величиной полиморфизма, а также статистически значимо отличаются от остальных групп по таким показателям, как ожидаемая гетерозиготность (H e и uH e ), число эффективных аллелей (N e ) и информационный индекс Шеннона (I) (см. таблицу). Данный водоем расположен в пойме р. Печора и большую часть года соединяется с ней протокой, а при весеннем половодье и заливается водами реки. Возможно, его заселение небольшим числом экземпляров верховки произошло относительно недавно. Это и могло бы объяснить низкое генетическое разнообразие данной группировки (эффект основателя). По мнению авторов [25], описывающих процесс инвазийного заселения верховкой некоторых водоемов на территории Англии, основную роль в ряде случаев играли рыбаки-любители. При этом главный предполагаемый механизм – перемещение икры и молоди рыб из водоема в водоем вместе с различным снаряжением (сети, неводы, садки), используемым в процессе рыбной ловли. Необходимо отметить, что нерестовый период у данного вида рыб длится все лето (порционное икрометание) и, как показала практика, в качестве нерестового субстрата могут использоваться сетные и удилищные поплавки, дно лодки и прочие предметы. Кладка икринок имеет вид строчек шириной в 1-2 икринки и приклеена к субстрату достаточно прочно. Существует небольшая вероятность того, что при быстром переезде на другой водоем (во влажных условиях) оплодотворенные икринки действительно могут попасть в воду и продолжить свое развитие.

Основными факторами, влияющими на генетическую структуру популяций, являются генетический дрейф, поток генов и естественный отбор [26]. Для водоема-охладителя ПГРЭС установлен факт интродукции и образования устойчивых группировок уклейки и карпа. Вместе с указанными видами в этот водоем могла попасть и верховка. Однако в случае исключительно инвазийного происхождения данного вида генетическое разнообразие изучаемого материала могло быть очень низким вследствие проявления «эффекта основателя». Возможно, изменение генетической структуры вызвано привнесением дополнительного генетического материала к уже существующей популяции.

Водоем-охладитель Печорской ГРЭС характеризуется непостоянным гидрохимическим и термическим режимами, зависящими от технологических процессов электростанции [27]. Влияние измененного температурного и химического режимов проявляется на различных уровнях организации: от дефектов развития у отдельных особей разных ви- дов рыб до исчезновения типичных видов (щука, плотва, окунь) из структуры рыбной части сообщества в целом [28,29]. Устранение прямого действия отбора (прессинг хищника) при оптимальных (для верховки) температурных параметрах среды также может способствовать изменению генетического разнообразия популяций рыб.

Генетическая выборочность при небольших объемах проанализированного материала в популяционном анализе может в свою очередь повлиять на результаты исследования. Так, например, значительная доля (81 %) молекулярной дисперсии (AMOVA) приходится на внутрипопуляционную генетическую изменчивость проанализированных особей, что свидетельствует о значительной разнородности исследованного генетического материала.

Таким образом, данные секвенирования участка мтДНК, кодирующего субъединицу 1 фермента цитохромоксидазы, свидетельствуют о едином механизме происхождения популяций верховки обыкновенной. Анализ полиморфизма длин амплифи-цированных фрагментов позволяет заключить, что проанализированные выборки генетических проб верховки характеризуются явным генетическим своеобразием. Уровень изменчивости генетических и морфологических признаков данного вида, наблюдаемый при продвижении на северо-восток Республики Коми, по-видимому, отражает процесс его естественного расселения и адаптации к условиям внешней среды. Корреляция между матрицами генетических и географических расстояний также говорит в пользу предложенной нами гипотезы.