Молекулярные маркеры чувствительности и резистентности карцином толстой кишки к терапии антагонистами EGFR

Современная онкология располагает широким спектром лекарственных средств для лечения метастатического рака толстой кишки (РТК) [11, 13]. В частности, РТК зачастую демонстрирует заметную чувствительность к цитостатикам: фторурацилу, оксалиплатину и иринотекану. В комбинации с химиотерапией применяются модуляторы ангиогенеза: бевацизумаб и афлиберцепт. Клиническое использование анти-EGFR антител (цетуксимаба, панитумумаба) основывается на представлениях о роли активации данного рецептора в патогенезе рака толстой кишки. Именно внедрение антагонистов EGFR в терапию РТК послужило отправной точкой для интеграции молекулярно-генетических тестов в практическую онкологию.

Статус гена EGFR

Цетуксимаб и панитумумаб взаимодействуют с EGFR, препятствуя его связыванию с лигандом и способствуя быстрой интернализации и деградации рецептора. Основная часть эффекта моноклональных анти-EGFR антител связана с ослаблением онкогенного сигнала, передающегося от мембраны к ядру. Первоначально обоснованием для применения этих препаратов служило обнаружение признаков выраженной экспрессии EGFR в большинстве случаев РТК (60–80 %) [43]. Предполагалось, что определение уровня экспрессии рецептора посредством иммуногистохимического (ИГХ) анализа послужит надежным предиктивным маркером ответа на терапию цетуксимабом или панитумумабом. Однако уже в ходе первых клинических испытаний терапевтических анти-EGFR антител стало понятно, что данное предположение не соответствует истине: ни присутствие, ни степень выраженности экспрессии EGFR не коррелировали с ответом на терапию [9, 43]. Следует отметить, что отчасти отсутствие предиктивной значимости ИГХ может быть обусловлено не только биологическими, но и методическими причинами [21].

Предпринимались попытки связать ответ на цетуксимаб с наличием мутаций в гене EGFR. Установлено, что мутации тирозинкиназного домена EGFR встречаются при РТК редко – в 0,5–1 % случаев [5, 8]. В то же время вплоть до 10–20 % первоначально отвечающих на терапию цетуксимабом больных РТК становятся вторично резистентны к ней в результате появления мутаций во внеклеточном домене EGFR [4, 34, 35]. Эти вновь приобретённые мутации препятствуют связыванию EGFR с цетуксимабом. Практически важно, что частая повторяющаяся мутация p.S492R, обеспечивая устойчивость к цетуксимабу, не ассоциирована с резистентностью опухоли к другому анти-EGFR антителу – панитумумабу [34].

Мутации в генах семейства RAS

Гены семейства RAS (KRAS, NRAS, HRAS) являются ключевыми участниками пролиферативного каскада RAS-MAPK. Мутации в KRAS встречаются при РТК в 30–45 % случаев [8, 15] и ассоциированы с отсутствием эффективности анти-EGFR терапии [3, 24, 30]. Необходимо упомянуть, что ошибочное назначение анти-EGFR терапии больным с мутациями в генах RAS может ухудшать показатели общей и безрецидивной продолжительности жизни пациентов [47]. Наиболее часто мутации выявляются во втором экзоне гена KRAS – в кодонах 12 и 13, поэтому первоначально тестирование проводилось только по этим позициям. Приблизительно в 6–11 % случаев РТК мутации приходятся на другие кодоны гена, в основном на 59, 61, 117 и 146 [8, 40, 47]. Среди гомологов KRAS, обладающих онкогенными свойствами, в РТК встречаются мутации в NRAS. Частота этих мутаций составляет 4–10 % [8, 15, 47]. Мутации чаще всего находятся в кодонах 61, 12 и 13. «Дополнительные» мутации в генах RAS также являются маркерами резистентности, поэтому «золотым стандартом» считается исследование всей кодирующей последовательности этих двух генов [11, 18, 33, 38, 47]. Малоизученным остается редкий феномен амплификаций гена KRAS. Они встречаются менее чем в 1 % РТК, но, возможно, также обеспечивают устойчивость к терапии анти-EGFR антителами [48].

Мутации в гене BRAF

Другим участником каскада RAS-MAPK является онкоген BRAF. Мутации BRAF наблюдаются в 10–12 % РТК [8, 15]. Наиболее частая мутация в этом онкогене — p.V600E. Около 60 % случаев РТК с мутациями p.V600E приходятся на опухоли с микросателлитной нестабильностью и так называемым метиляторным фенотипом. Эти опухоли, как правило, расположены на правой стороне толстой кишки. Они чаще возникают у женщин и у больных пожилого возраста. Подобно другим опухолям с микросателлитной нестабильностью, эти новообразования в целом характеризуются благоприятным прогнозом. Оставшиеся 40 % BRAF-мутированных РТК развиваются вне связи с микросателлитной нестабильностью и отличаются очень агрессивным течением [46]. Предположение о предиктивной роли мутаций в гене BRAF сделано давно [7, 11, 33]. Оно превосходно укладывается в существующие теоретические представления о пролиферативных сигнальных каскадах. Однако подтвердить роль мутаций в гене BRAF в формировании резистентности к антагонистам EGFR представляется сложным вследствие относительной редкости данного события. Даже опубликованные метаанализы ответа BRAF-мутированных опухолей несколько расходятся по своим выводам: в то время как одни авторы говорит о полной резистентности BRAF-мутированных опухолей к анти-EGFR антителам, другие указывают лишь на уменьшение степени выраженности ответа опухоли на терапию [39, 42]. На небольших сериях больных РТК с мутацией BRAF p.V600E показан выраженный терапевтический эффект комбинации ингибиторов EGFR и мутированного BRAF [2].

Интересно, что роль собственно микроса-теллитной нестабильности как потенциального предиктивного или прогностического маркера анти-EGFR терапии остаётся неизученной, и стратификации мутаций BRAF по этому признаку также не проводилось. Известно, что иммунный статус микроокружения опухолей с микросател-литной нестабильностью обладает отличительными особенностями [31]. В то же время эффект терапии анти-EGFR антителами, по крайней мере отчасти, принято объяснять так называемой антителозависимой цитотоксичностью [45]. Потенциально ответ на терапию может различаться в зависимости от наличия или отсутствия микро-сателлитной нестабильности и соответствующего иммунного статуса микроокружения опухоли.

Мутации p.V600E являются наиболее частым повреждением BRAF при РТК, однако у некоторых больных обнаруживается другая аминокислотная замена – p.D594G [52]. Между тем, возможно, она вызывает уменьшение киназной активности BRAF, связана с благоприятным прогнозом и не способствует резистентности к анти-EGFR терапии [10, 11].

PIK3CA, PTEN, HER2 и MET

В 14–18 % РТК выявляют мутации PIK3CA. Этот ген – каталитическая субъединица киназы PI3K из каскада PI3K/AKT. Чаще всего встречаются мутации в экзоне 9 – p.E542K и p.E545K (~70 %), а также в экзоне 20 – p.H1047R (~30 %) [8, 15]. Мутации в экзоне 9 активируют каталитическую субъединицу PIK3CA вне зависимости от статуса тирозинкиназ, но оставляют возможность ее дополнительной модификации при взаимодействии с RAS белками. Мутации в экзоне 20, наоборот, активируют этот белок независимо от взаимодействия с RAS белками, но допускают дополнительную активацию со стороны тирозинкиназ [14]. Исходя из этого, кажется логичным, что мутации в экзоне 9 обычно встречаются в сочетании с мутациями генов RAS, а генетические повреждения в экзоне 20 возникают независимо [11]. Согласно недавнему метаанализу, мутации в экзоне 20 способствуют резистентности к анти-EGFR терапии, а изолированные дефекты в экзоне 9 могут быть с ней не связаны [20].

В 6–10 % случаев РТК встречаются инактивирующие мутации в гене PTEN – негативном регуляторе каскада PI3K/Akt [8, 15]. Еще чаще наблюдают сниженную экспрессию PTEN. Предиктивная роль сниженной экспрессии и/или инактивирующих мутаций PTEN является предметом интенсивного изучения и дискуссии [16, 32, 51]. В недавно опубликованном метаанализе показана предиктивная значимость утраты экспрессии гена PTEN [51]. Тем не менее тесты на определение статуса PIK3CA и PTEN пока не стали компонентом клинической практики как вследствие недостатка фактической информации, так и по причине недостаточной стандартизации соответствующих лабораторных методик.

Хотя активация гена HER2/neu в РТК открыта много лет назад [37], лишь недавно этот аспект стал активно изучаться в онкологической колопроктоло-гии. Действительно, примерно в 7 % РТК наблюдаются амплификации или активирующие точковые мутации HER2/neu. Судя по экспериментальным данным, они ассоциированы с резистентностью РТК к анти-EGFR терапии [53]. С другой стороны, активация HER2 может обеспечивать чувствительность опухоли к ингибиторам этого рецептора, в частности к трастузумабу [12] или так называемым малым молекулам [25]. Точковые мутации HER2 встречаются примерно в 15 % РТК, развившихся на фоне синдрома Линча или в результате соматических мутаций в генах, ассоциированных с этим синдромом [28]. Следует заметить, что многие из этих мутаций могут не иметь самостоятельного биологического значения, а отражать «мутационный шум». Еще одна вероятная причина как первичной, так и вторичной резистентности к анти-EGFR терапии – амплификация рецепторной тирозинкиназы MET. Это событие наблюдается в РТК достаточно редко, поэтому его изучение сопряжено со значительными трудностями [6].

Заключение

Детекция кодирующих мутаций в онкогенах KRAS и NRAS стала неотъемлемой частью лабораторного исследования опухолей толстой кишки. Выявление других маркеров пока остаётся предметом экспериментальных исследований, хотя многие из соответствующих тестов имеют шансы на клиническое применение. Продолжают совершенствоваться методические аспекты молекулярной диагностики РТК. Первоначально KRAS/NRAS-тестирование основывалось на аллель-специфической ПЦР [3]. Эта методика отличается уникальной чувствительностью, однако способна выявлять лишь небольшой спектр повторяющихся мутаций. Появление новых требований к анализу полной кодирующей последовательности генов KRAS и NRAS привело к более частому использованию секвенирования по Сэнгеру и/или пиросеквенирования [49]. Однако «классические» методы секвенирования требуют достаточно высокого содержания опухолевых клеток в исследуемом материале – выявить подобные участки опухоли удаётся не во всех образцах, поступающих на молекулярное тестирование. Появление принципиально новых методов ДНК-анализа, в частности секвенирования нового поколения, позволило многократно повысить чувствительность детекции мутантных аллелей [17, 27]. Недавние работы указывают на тот факт, что некоторые РТК содержат значимые мутации лишь в небольшом проценте опухолевых клеток, т.е. обладают значительной внутриопухолевой гетерогенностью [17, 29]. Клиническое значение мозаичных мутаций нуждается в дальнейшем изучении [29].

Данная работа поддержана грантом РНФ 14-25-00111.