Молекулярные механизмы, опосредующие развитие холангиокарциномы в ходе хронической инвазии печеночными сосальщиками

В Российской Федерации в 2013 г. было выявлено свыше 535 000 новых случаев заболевания раком, что на 15,0 % больше, чем в 2003 г. Злокачественные новообразования устойчиво занимают второе место среди причин смертности населения России. Их удельный вес в общей структуре смертности составляет около 14 % [7]. Холангиокарци-нома (ХК) является сравнительно редкой формой рака и составляет менее 1 % от общего объема злокачественных новообразований. Тем не менее ХК является второй по распространенности формой первичного рака печени в некоторых регионах Америки, Европы и Азии. Первичный рак желчных протоков характеризуется неблагоприятным прогнозом, низкой эффективностью применяемых методов лечения, а также низким уровнем пятилетней выживаемости, не превышающим 5 %, что во многом обусловлено поздней диагностикой, до 60 % случаев ХК диагностируются на III–IV стадиях [8, 9].

Показана связь между высокой частотой возникновения ХК и заболеваемостью описторхозом и клонорхозом в странах с эндемическими очагами инвазии Opisthorchis viverrini, Clonorchis sinensis [10]. По данным международных эпидемиологических исследований, заболеваемость ХК в европейских странах варьирует от 2 до 8 на 100 тыс. В регионах Китая и Республики Корея, являющихся эндемичными очагами инвазии C. sinensis, заболеваемость ХК составляет 32 случая на 100 тыс. В

Северных регионах Тайланда, которые являются эндемичными очагами инвазии O. viverrini , заболеваемость ХК достигает 96 случаев на 100 тыс. [3]. В Российской Федерации также существует несколько эндемических очагов заболеваемости описторхозом ( O. felineus ). Из них самые крупные находятся на территории Ханты-Мансийского и Ямало-Ненецкого автономных округов, а также Тюменской, Томской, Омской и Новосибирской областей [2].

Фундаментальных исследований, построенных на принципах доказательной медицины, о связи инвазии O. felineus и ХК в России не проводилось. Согласно госпитальным регистрам у больных описторхозом в 8–13 % случаев выявляется рак желчных протоков различных видов [4]. В эндемических очагах рак печени и внутрипеченочных желчных протоков встречается в 3–9 раз, а внепеченочных желчных протоков – в 13 раз чаще, чем на остальных территориях [5]. Канцерогенный потенциал O. felineus показан на экспериментальных моделях: мариты O. felineus способствуют возникновению у золотистых хомяков таких патологических изменений желчных протоков, как гиперплазия эпителия и перидуктальный фиброз, которые являются состоянием, предшествующим ХК [27].

Взаимосвязь между инвазией печеночными сосальщиками и ХК активно исследуется. Понимание этиологии ХК и молекулярных механизмов канце-

рогенеза позволит разработать новые методы ранней диагностики ХК с помощью молекул-маркеров. Кроме того, изучение молекулярных аспектов канцерогенеза при описторхозе в перспективе может привести к обнаружению новых терапевтических мишеней при ХК, а также существенно увеличить эффективность методов химиотерапии.

Факторы рискаразвития холангиокарциномы

В настоящее время определены основные факторы риска формирования холангиокарциномы, к которым, в первую очередь, относятся такие заболевания, как первичный склерозирующий холангит, цирроз печени, кисты желчных протоков, желчнокаменная болезнь, гепатит В и С, алкоголизм, воспалительные заболевания кишечника (болезнь Крона и язвенный колит). Кроме того, риск развития ХК зависит от генетических особенностей организма и особенностей диеты (канцерогены, которые содержатся в пище или образуются в ходе ее приготовления) [43]. Могут увеличивать риск развития холангиокарциномы различные виды бактерий Helicobacter (H. pylori, H. bilis, H. Hepaticus, H. ganmani) [50] и инвазия печеночными сосальщиками. В ряде исследований доказана канцерогенность некоторых печеночных сосальщиков [10, 22]. В 2012 г. Международным агентством по изучению рака (МАИР) O. viverrini и C. sinensis были признаны канцерогенами 1 класса. Кроме того, развитие внутрипеченочной ХК может быть индуцировано инвазией Fasciola gigantica или F. hepatica [26]. По данным ВОЗ, по меньшей мере 56 млн человек в мире страдают от одной или более трематодных инфекций пищевого происхождения. Случаи подобных инфекций зарегистрированы более чем в 70 странах мира; однако наиболее высокая заболеваемость отмечается в странах Юго-Восточной Азии и Южной Америки [1].

Механизмы индукции канцерогенеза печеночными сосальщиками

Установлено, что хроническая инвазия C. sinensis или O. viverrini может инициировать или способствовать канцерогенезу тремя путями [37]:

• 1.    Иммуновоспалительный путь. В эксперименте с инвазией O. viverrini показано, что в ответ на антигены описторхов развивается воспалительный иммунный ответ организма хозяина. Иммунный ответ направлен на устранение патогена и его элиминацию из организма, однако в случае инвазии печеночными сосальщиками элиминации гельминта не происходит и в результате развивается вторично-хроническое воспаление [29]. Хроническое воспаление характеризуется длительной стимуляцией клеток иммунной системы, изменением профиля продуцируемых ими цитокинов, а также миграцией активированных макрофагов

• 2.    Механический путь. Альтерация и воспаление желчных протоков происходят за счет механического воздействия сосальщиками в процессе питания и передвижения. Обе, ротовая и вентральная, присоски паразита присасываются к стенке желчного протока и нарушают целостность холангиоцитов, что способствует поддержанию хронического воспаления [37]. Помимо повреждения эпителия желчных протоков присосками, мариты описторхов механически препятствуют нормальному оттоку желчи. Есть данные о том, что компоненты застоявшейся желчи могут взаимодействовать друг с другом, а также с активными формами кислорода в очаге воспаления, в результате чего образуются эндогенные канцерогены, которые оказывают мутагенное воздействие на ДНК холангиоцитов [20, 47]. Со временем повреждения стенок желчных протоков становятся более выраженными, происходит изъязвление в местах присасывания паразитов. Яйца описторхов могут проникать в перидуктальные ткани через язвы и вызывать гранулематозное воспаление, что приводит к развитию перидуктального фиброза [22]. Кроме того, показано, что паразиты увеличивают восприимчивость холангиоцитов к эндогенным и экзогенным канцерогенам и ускоряют канцерогенез за счет хронического раздражения [31].

• 3.    Воздействие секреторных и экскреторных продуктов описторхов на эпителиальные клетки желчных протоков. Паразиты экскретируют низкомолекулярные продукты метаболизма, которые сами по себе или после взаимодействия с компонентами желчи или с активными формами кислорода могут проникать через мембраны клеток эпителия желчных протоков и оказывать свое токсическое и канцерогенное воздействие [42]. Кроме того, в процессе жизнедеятельности описторхи секретируют множество белковых продуктов, которые выполняют функции защиты паразита от иммунной системы хозяина, участвуют в поглощении пищи, облегчают внедрение паразита в ткани хозяина [29]. Секреторные продукты

и полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПЯЛ) в очаг воспаления. Активированные макрофаги и ПЯЛ продуцируют активные формы кислорода, протеолитические ферменты, цитокины с про-воспалительным эффектом и ростовые факторы. Наличие этих продуктов в очаге воспаления приводит к параллельному развитию двух процессов: альтерации окружающих клеток и в то же время активной регенерации поврежденных тканей [30]. Известно, что наличие длительного повреждения холангиоцитов и митогенное действие ростовых факторов являются промежуточными звеньями формирования таких гепатобилиарных патологий при описторхозе, как перидуктальный фиброз, стриктуры и кисты желчных протоков с развитием холестаза, а также приводят к развитию холангио-карциномы [38].

описторхов также могут способствовать созданию онкогенной среды в организме. Установлено, что некоторые из этих продуктов являются митогенами и способны нарушать регуляцию клеток организма хозяина. Например, в эксперименте на мышиных фибробластах клетки, которые культивировали с маритами O. viverrini пролиферировали в 4 раза быстрее, чем в культуре без марит. Доказано, что O. viverrini выделяет в желчь гранулиноподобный фактор роста-1 (Ov-GRN-1), который стимулирует пролиферацию клеток хозяина, препятствует апоптозу, вызывает гиперплазию и метаплазию эпителия желчных протоков [35]. Помимо этого установлено, что цистеиновые протеиназы (катепсин F и катепсин В), секретируемые O. viverrini способствуют возникновению ХК в результате повреждения желчных протоков [40]. Естественно, что все секреторные белковые продукты паразитов являются иммуногенными и способствуют поддержанию хронического воспаления.

Согласно последним данным, существует еще один путь индукции канцерогенеза печеночными сосальщиками. Мариты O. viverrini являются переносчиками онкогенной микробиоты, в частности бактерий рода Helicobacter. Известно, что H. hepaticus и H. bilis являются факторами развития заболеваний гепатобилиарной системы, а также способствуют возникновению колоректального рака и опухолей желчных протоков [12]. Таким образом, паразиты могут способствовать возникновению ХК за счет переноса в организм хозяина онкогенной микрофлоры или создания условий для ее существования.

Таким образом, несмотря на то, что механизмы взаимоотношений в системе паразит – хозяин пока досконально не изучены, можно утверждать, что инвазия печеночных сосальщиков существенно увеличивает риск возникновения холангиокарци-номы, главным образом путем модуляции воспалительного иммунного ответа организма хозяина.

Хроническое воспаление и холангиокарцинома

Важнейшим фактором, который обусловливает формирование ХК при описторхозной инвазии, является хроническое воспаление. Эти молекулярные процессы основываются на нескольких основных механизмах. В первую очередь, хроническое воспаление при описторхозной инвазии приводит к активации ядерного фактора транскрипции каппа b (NF-κВ) различными путями, а также индуцирует продукцию провоспалительных интерлейкинов (IL) [30]. Этот фактор контролирует экспрессию генов, участвующих в регуляции воспаления, апоптоза и клеточного цикла. Известно, что изменение регуляции этого транскрипционного фактора сопутствует развитию инфекционно-воспалительных и аутоиммунных заболеваний, а также раковых опухолей. NF-κВ может быть активирован раз- личными стимулами, такими как цитокины (IL-1, TNF), лиганды толл-подобных рецепторов, активные формы кислорода [19].

Роль IL-6 в канцерогенезе

Цитокины и факторы роста, обладающие про-воспалительным и пролиферативным действием, такие как IL-6, IL-8, IL-12, фактор некроза опухоли (TNF-α), фактор роста гепатоцитов (HGF), трансформирующие факторы роста альфа и бета (TGF-α и TGF-β), эпидермальный фактор роста (EGF), а также фактор роста фибробластов (FGF) участвуют в патогенезе ХК [28]. Исследователи отмечают, что IL-6 играет центральную роль в малигнизации холангиоцитов [39, 41]. Установлено, что ответ на стимуляцию IL-6 различается у нормальных и злокачественных клеток. В клетках ХК наблюдается гиперэкспрессия гена, кодирующего интерлейкин 6, и гена, кодирующего рецептор к IL-6, а также высокое содержание митоген-активируемой про-теинкиназы р38 (р38 МАРК). IL-6 способствует канцерогенезу эпителия желчных протоков несколькими путями [8]. Одним из таких механизмов является изменение экспрессии микроРНК, что приводит к нарушению клеточного цикла и препятствует апоптозу аномальных клеток. Показано, что активация р38 МАРК посредством IL-6 приводит к снижению экспрессии микроРНК-373, а также есть сведения о значительном снижении уровня экспрессии микроРНК-214 [11, 24]. Результаты других исследований свидетельствуют об увеличении экспрессии микроРНК-21 [44]. IL-6 также может изменять статус метилирования ДНК в холангиоцитах путем увеличения экспрессии гена ДНК метилтрансферазы-1 (DNMT-1). Активация DNMT-1 приводит к метилированию генов-онкосупрессоров ( p14(ARF), DAPK, ASC ), что способствует накоплению онкогенных мутаций с последующей бесконтрольной пролиферацией аномальных клеток [45]. Кроме того, IL-6 способствует выживанию клеток с поврежденной ДНК, за счет увеличения содержания антиапоптотического белка Mcl-1 в результате активации р38 МАРК и белка STAT3. Таким образом, активация рецептора IL-6, приводит к запуску нескольких молекулярных путей, которые опосредуют развитие рака: JAK/ STAT3, p38MAPK, ERK1/2 и PI3K/Akt [18].

Роль оксидативного стрессав формировании рака желчных протоков

При воспалении происходит цитокинзависи-мая активация эффекторных клеток иммунной системы. Активированные макрофаги и ПЯЛ продуцируют активные формы кислорода и азота (АФК), вызывая окислительный стресс клеток желчных протоков [32]. В экспериментах было показано, что антигены паразитов могут стимулировать экспрессию индуцибельной NO-синтазы не только в клетках иммунной системы, но и в самих клетках эпителия желчных протоков, что также приводит к окислительным модификациям ДНК холангиоцитов. Избыточные концентрации NO и других активных форм кислорода оказывают прямой цитотоксический и мутагенный эффект, могут приводить к нарушению клеточного цикла. АФК также могут способствовать формированию холангиокарциномы путем активации NF-kB и угнетения апоптоза поврежденных клеток, например в результате нитрозирования каспазы 9 [33]. В эксперименте было показано, что инвазия O. viver-rini у хомяков приводит к накоплению в клетках эпителия желчных протоков 8-нитрогуанина и 8-оксо-7,8-дигидрокси-2-дезоксигуанина, которые являются маркерами окислительного повреждения ДНК [34]. К тому же оксидативный стресс приводит к запуску перекисного окисления липидов (ПОЛ). Продукты ПОЛ также могут повреждать ДНК, что приводит к возникновению онкогенных мутаций [13].

Помимо этого, АФК могут вызывать дукталь-ный холестаз путем ингибирования ионных транспортеров желчевыводящих клеток [36]. Известно, что в желчи пациентов с воспалительными заболеваниями печени, сопровождающимися холестазом, содержатся оксистеролы в высоких концентрациях: 7-α-гидроксихолестерол, 7-β-гидроксихолестерол, холестантриол и 7-кетохолестерол, а также повышенные концентрации желчных кислот [21]. Оксистеролы способствуют возникновению рака желчных протоков путем угнетения антиоксидантных механизмов защиты клеток и непосредственного окислительного повреждения ДНК [25]. Желчные кислоты вызывают гиперэкспрессию гена циклооксигеназы-2 (COX-2), подавляют экспрессию гена E-кадгерина, а также активируют рецептор к эпидермальному фактору роста, что приводит к нарушению деградации антиапоп-тотического белка Mcl-1. Тем самым желчные кислоты способствуют формированию ХК, путем выживания поврежденных клеток и стимуляции их пролиферации [14, 46, 48]. Описан еще один путь, благодаря которому воспаление может привести к развитию рака. Запуск NF-κВ АФК и провос-палительными цитокинами может привести к избыточной активации цитидин-деаминазы, которая оказывает прямое мутагенное действие на ДНК холангиоцитов [23].

Родь рецептора конечных продуктов гликирования (RAGE) в канцерогенезе холангиокарциномы

В эксперименте показано, что в ходе воспаления активируется рецептор конечных продуктов гликирования (RAGE) и увеличивается экспрессия гена, кодирующего этот белок. RAGE является мульти-лигандным паттерн-распознающим рецептором и может быть активирован конечными продуктами гликирования, молекулами семейства S100 или молекулой белка Б1 высокомобильной группы (HMGB1). Взаимодействие RAGE с лигандом приводит к активации NF-kB с помощью белка MyD88, а также активирует сигнальные пути, опосредованные p38 МАРК, ERK 1/2, JNK, JAK, STAT и Rac-Cdc42. Массовая активация сигнальных путей приводит к генерации активных форм кислорода и синтезу провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-8. Таким образом, RAGE замыкает «порочный круг» и способствует поддержанию хронического воспаления [16].

Роль матриксных металлопротеиназв формировании ХК

Матриксные металлопротеиназы (MMП) представляют собой семейство цинк- и кальцийзависи-мых эндопептидаз, которые играют важную роль в развитии различных заболеваний, в том числе злокачественных новообразований [6]. Воспаление может приводить к увеличению экспрессии генов некоторых ММП, таких как ММП-2, ММП-7 и ММП-9 [49]. Установлено, что MMП-7 может способствовать развитию ХК, за счет индукции пролиферации клеток путем активации рецептора к эпидермальному фактору роста (EGFR). Кроме того, матриксные металлопротеиназы (MMП) участвуют в метастазировании раковых клеток. Показано, что в сформировавшейся ХК матрикс-ные металлопротеиназы ММП-7, ММП-9 способствуют пролиферации и метастазированию клеток опухоли за счет деградации коллагена IV типа, фибронектина и ламинина [15]. По результатам других исследований установлено, что активация RAGE приводит к увеличению экспрессии гена, кодирующего фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и гена, кодирующего ММП-2. VEGF и MMП-2 способствуют формированию капилляров в растущей опухоли [17].

Заключение

Инвазия печеночными сосальщиками является одним из факторов, способствующих развитию рака желчных протоков. Выделяют три основных пути, способствующих канцерогенезу желчных протоков при хронической описторхозной инвазии: иммуновоспалительный механизм, механическое воздействие, а также влияние экскреторных и секреторных продуктов паразитов на клетки желчных протоков. Кроме того, изучается возможность переноса паразитами в организм хозяина онкогенной микрофлоры.

Важными молекулярными звеньями и механизмами, которые обусловливают развитие ХК в результате хронического воспаления, вызванного описторхозной инвазией, являются запуск сигнального пути, опосредованного NF-κВ, дисбаланс продукции провоспалительных цитокинов, в частности, центральная роль отводится IL-6, активация рецептора для конечных продуктов гликирования

RAGE, который способствует поддержанию хронического воспаления, и экспрессия матриксных металлопротеиназ (ММП-7 и ММП-9), которые обладают митогенным эффектом. Помимо этого, известно, что важным фактором в формировании ХК при описторхозе является окислительный стресс. Генерация АФК, оксида азота II (NO) и продукция оксистеролов играют решающую роль в формировании онкогенных мутаций в ДНК клеток печени.

Современные исследования молекулярных основ формирования ХК на фоне описторхоза