Молекулярные механизмы участия урокиназной системы в канцерогенезе, метастазировании и эпителиально-мезенхимальном переходе

Экспериментальная онкология клеток, которое позволили бы выявить новые ключевые мишени для терапевтического воздействия.

Материалы и методы: В работе были использованы линейные клетки нейробластомы мыши Neuro2a. Для подавления экспрессии гена рецептора урокиназы uPAR использовали технологию редактирования генома CRISPR/Cas9; для гиперэкспрессии uPAR и ре-экспрессии в клонах, не экспрессирующих uPAR, использовали плазмидную конструкцию, содержащую кДНК рецептора урокиназы мыши. Для оценки экспрессии белков использовали методы полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, вестерн блота, проточной цитофлуориметрии и иммунофлуоресцентного окрашивания клеток в сочетании с конфокальной микроскопией. Миграцию клеток анализировали с использованием метода царапины на монослое (wound scratch assay), клеточный индекс — с использованием прижизненной системы IncuCyte. Влияние урокиназного рецептора на развитие химиорезистенности опухолевых клеток оценивали после инкубации клеток в присутствии 30?M цисплатина в течение 24 часа. Для количественной оценки активности каспазы-3 использовали тест-систему, основанную на реакции со специфическим субстратом. Непарные t-тесты Student использовались для сравнения данных между двумя группами. Множественные сравнения проводили с использованием ANOVA, post hoc тест Tukey. Критический уровень значимости принимали равным р < 0,05.

Результаты: Мы показали, что использование технологии CRISPR/Cas9 для выключения экспрессии гена uPAR в клетках нейробластомы мыши Neuro2a приводит к значительному (на 60%, p <0,05) снижению пролиферации клеток и уменьшению экспрессию основного маркера пролиферации клеток — Ki-67. В клетках с нокаутированным uPAR активируется каспаза-3 и накапливается низкомолекулярная форма белка PARP-1, свидетельствующая о деградации ДНК и гибели клеток по механизму апоптоза. Мы обнаружили, что экспрессия uPAR вызывает значительные изменения морфологии клеток: нокаут uPAR приводит к достоверному увеличению среднего размера клеток, тогда как гиперэкспрессия uPAR — к противоположному эффекту. Мы впервые показали, что нокаут uPAR в клетках нейробластомы индуцирует в них ЭМП переход, увеличивает миграцию, подавляет экспрессию эпителиальных маркеров (E-кадге-рина, окклюдина и кладудина-5) и активирует экспрессию мезенхимных маркеров (N-кадгерина, интерлейкина-6 и α-SMA). При этом подавление экспрессии uPAR сопровождается изменением внутриклеточной сигнализации суча-стием киназы Erk1/2, активацией миграции и снижением способности клеток формировать эпителиальные колонии, т.е., приводит к утрате эпителиального фенотипа. Поиск молекулярного механизма выявил урокиназу в качестве ключевого регулятора этих процессов: отсутствие uPAR на мембране клеток нейробластомы приводит к транслокации урокиназы в ядро и активации транскрипционных факторов ЭМП-программы — NF-kß и Snail. При этом изменение экспрессии uPAR не влияет на маркеры стволовости в Neuro2a клетках — нокаут uPAR никак не отражался на уровне экспрессии мРНК основных генов плюрипотентности Nanog, Oct4 и Sox2. Следует отметить, что, нокаут uPAR приводит к увеличению химиорезистентности опухолевых клеток по сравнению с клетками дикого типа: добавление цисплатина в среду культивирования клеток, не экспрессирующих урокиназный рецептор, вызывает снижение экспрессии каспазы-3 и ее энзиматической активности, а также снижает содержание низкомолекулярной формы белка PARP-1. Полученные нами данные позволяют предполагать, что мы обнаружили новый механизм функционирования урокиназной системы в нейробластоме, при котором uPAR, являясь «ловушкой» для uPA, связывает ее на мембране и регулирует ее протеазную активность. Экспрессия uPAR обеспечивает поддержание эпителиального фенотипа клеток Neuro2a. Нокаут uPAR хоть и снижает пролиферацию клеток, тем не менее, приводит к транслокации uPA в ядро и активации экспрессии генов ЭМП, увеличению миграторного потенциала Neuro2a клеток. Заключение: Наши данные позволяют предполагать, что uPAR в клетках опухоли является многофункциональной молекулой. Сложность молекулярных каскадов и многогранность перекрестных сигнальных путей, активируемых урокиназной системой, возможно, является причиной отсутствия положительных эффектов от использования блокирующих урокиназную систему агентов в клинических исследованиях в онкологии.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 19-75-30007).