Молекулярные особенности прогрессирования рака шейки матки I-II стадии

Рак шейки матки (РШМ) занимает 8-е место среди злокачественных новообразований в мире и 9-е место среди причин смертности от рака [1]. Наиболее часто РШМ выявляется в возрасте до 45 лет (43 % всех случаев), а в возрастной группе до 40 лет – в 28–30 % случаев [2, 3]. При этом показатели 5-летней выживаемости варьируются от 15 до 80 % и напрямую зависят от стадии заболевания [4].

Стандартом лечения ранних стадий РШМ является радикальная операция, в том числе в сочетании с химиотерапией. При невозможности хирургического лечения применяется лучевая терапия в самостоятельном виде или в условиях радиомодификации [5, 6]. Однако выбор оптимальной лечебной тактики для пациенток с РШМ I–II стадии остается сложной задачей, зависящей от распространенности процесса и факторов риска прогрессирования [7]. Так, в течение 2 лет после лечения наблюдается высокий риск местных рецидивов и гематогенных метастазов [8, 9], что стимулирует поиск новых биологических маркеров, позволяющих предсказывать эффективность лечения и прогнозировать исход заболевания. Большинство ранее проведенных исследований основано на иммуногистохимическом анализе [10–12] и изучении генных сигнатур. Выявлены 3 иммунных подтипа РШМ, различающихся между собой по прогнозу [13], гены SERPINE1, TNF, CA9, CAMK2A, CYBB, IL1A и IL1B, ответственные за неблагоприятный исход РШМ, и сигнатура из 16 генов, позволяющая стратифицировать больных на группы высокого и низкого риска прогрессирования [14–16]. Однако эти и многие другие маркеры не внедрены в клиническую практику из-за отсутствия воспроизводимости и недостаточной эффективности [17].

Цель исследования – выявление особенностей и маркеров прогрессирования РШМ I–II стадии.

Материал и методы

В исследование включено 103 пациентки с диагнозом РШМ стадии IA–IIB (T1а–2bN0M0), которым на первом этапе выполнено радикальное хирургическое лечение в соответствии с клиническими рекомендациями. Средний возраст составил

Таблица 1/table 1

Clinicopathological parameters of patients with stage i–ii cervical cancer

Показатель/Parameter		Число пациенток/ Number of patients	Доля пациенток, [95 % ДИ]/ Proportion, [95 % CI]
Гистологический тип/	Аденокацинома/Adenocarcinoma	5	4,9 % [0,7 %; 9,1 %]
Histological type	Плоскоклеточный рак/Squamous cell carcinoma	98	95,1 % [91,0 %; 99,3 %]
Возраст, лет/	18–44	53	51,5 % [41,8 %; 61,1 %]
	45–59	30	29,1 % [20,4 %; 37,9 %]
Age, years	60–74	20	19,4 % [11, 8 %; 27,1 %]
Нарушения цикла/Menstrual irregularities		30	29,1 % [20,4 %; 37,9 %]
	Боли/Pain	38	36,9 % [27,6 %; 46,2 %]
Кровянистые выделения/Vaginal discharge		64	62,1 % [52,8 %; 71,5 %]
Эрозия шейки матки/Cervical erosion		72	69,9 % [61,0 %; 78,8 %]
Осложнения лечения/Treatment complications		18	17,5 % [10,1 %; 24,8 %]
Прогрессирование/Progressive disease		10	9,7 % [4,0 %; 15,4 %]
	IA1	8	7,8 % [2,6 %; 12,9 %]
Распределение по стадиям/ Stage distribution	IA2	10	9,7 % [4,0 %; 15,4 %]
	IIB1	45	43,7 % [34,1 %; 53,3 %]
	IIB2	40	38,8 % [29,4 %; 48,3 %]
Пятилетняя безреци-	IA	91,7 %
дивная кумулятивная	IB	87,7 %
выживаемость/
5-year disease-free	IIA	89 %
cumulative survival	IIB	84 %

Примечание: таблица составлена авторами.

Note: created by the authors.

Клинико-морфологические параметры больных РШМ i–ii стадии

47,0 ± 12,0 лет. Морфологический вариант опухоли определялся в соответствии с Международной классификацией РШМ [18]. На основании гистологического исследования операционного материала и практических рекомендаций Российского общества клинической онкологии (RUSSCO) по РШМ [19] пациентки стратифицировались по группам риска прогрессирования для индивидуализации тактики лечения. Больным высокого и промежуточного риска (n=64) в послеоперационном периоде проводилась адъювантная химиолучевая терапия в стандартном режиме с РОД 2 Гр 5 дней в нед до СОД 44–48 Гр и в виде внутриполостной лучевой терапии с РОД 5 Гр 2 дня в нед до СОД 50 Гр. Одновременно с лучевой терапией больным проводилось внутривенное введение цисплатина в дозе 40 мг/м ² 1 раз в нед. Выполнялась оценка эффективности лечения, частоты и сроков появления рецидивов и метастазов. Для анализа отдаленных результатов прослеживались исходы лечения в течение 5 лет. Клинико-морфологическая характеристика пациенток представлена в табл. 1.

Формалин-фиксированные парафин-залитые (FFPE) образцы первичной опухоли, полученные при выполнении хирургического лечения и гистологически верифицированные, использовались для полнотранскриптомного секвенирования. Тотальную РНК выделяли из FFPE образцов первичной опухолевой ткани (n=8) с использованием набора SKYprep RNA Pure FFPE Kit (Skygen, Россия) со- гласно стандартному протоколу. Выделенную РНК использовали для подготовки кДНК-библиотек с помощью набора VAHTS Universal V8 RNA-seq Library Prep Kit for Illumina (Vazyme, Китай). Подготовленные библиотеки секвенировали на платформе Genolab M (GeneMind Biosciences, Китай) в режиме одноконцевого прочтения по 75 нуклеотидов.

Валидация результатов секвенирования проводилась с помощью публично доступных данных секвенирования РНК 7 пациенток с прогрессированием заболевания (рецидив, метастазирование или плохой исход) и 4 пациенток без прогрессирования заболевания (T1a–2bN0M0), полученных из Атласа генома рака (The Cancer Genome Atlas, TCGA; . Идентификация дифференциально-экспрессирующихся генов (ДЭГ) была выполнена с использованием пакета DESeq2 в среде R с пороговыми значениями |log2FC|≥1 и p.adj<0,05.

Контроль качества секвенирования РНК проводили с помощью программных пакетов FastQC fastqc) и MultiQC [20]. Картирование прочтений на референсный геном GRCh38 проводили при помощи программы STAR [21]. Количественную оценку экспрессии генов выполняли при помощи HTSeq-count [22]. Анализ дифференциальной экспрессии проводили с помощью пакета DESeq2 в среде R с пороговыми значениями |log2FC|≥0,75

Таблица 2/table 2

Гены, ассоциированные с прогрессированием РШМ i–ii стадии

Genes associated with stage i–ii cervical cancer progression

Ген/Gene	Log2FC	Stat	p	p.adj
Гиперэкспрессия/Upregulation
ITGA6	3,327	4,492	7,05E-06	0,004
IFI44L	3,433	4,279	1,87E-05	0,006
LAMC2	3,584	4,009	6,1E-05	0,010
SH3RF2	2,385	3,946	7,96E-05	0,011
DDIT4	5,231	3,936	8,3E-05	0,012
Гипоэкспрессия/Downregulation
PCDH10	-3,707	-4,523	6,11E-06	0,004
UGT3A2	-4,044	-4,722	2,34E-06	0,003

Примечания: Log2FC – логарифм кратности изменения уровня экспрессии генов между больными с и без прогрессирования заболевания; Stat – значение статистического теста Вальда; p.adj – p-значение, скорректированное на множественные сравнения методом Бонферрони для одновременного тестирования дифференциальной экспрессии всех анализируемых генов (n=1035); таблица составлена авторами.

Notes: Log2FC, log2 fold change in gene expression levels between patients with and without disease progression; Stat, Wald test statistic value; p.adj, p-value adjusted for multiple comparisons using the Bonferroni method for simultaneous testing of differential expression across all analyzed genes (n=1035); created by the authors.

и p.adj<0,05 [23]. Для функционального аннотирования ДЭГ использовали анализ обогащения сигнальных путей fgsea [24] на основе базы данных Hallmark gene sets. Визуализацию результатов осуществляли с помощью пакетов ggplot2, pheatmap и онлайн-платформы Phantasus. Различия принимались статистически значимыми при p≤0,05 и на уровне тенденции при p≤0,1.

Статистическая обработка результатов выполнялась с помощью программы STATISTICA 12 (StatSoft, США). Статистическую значимость различий между группами по качественным признакам (гистологический тип опухоли, наличие клинических симптомов, осложнения лечения, прогрессирование заболевания) определяли с помощью критерия χ ² Пирсона для сравнения абсолютных частот. Для относительных частот качественных признаков рассчитывали 95 % доверительные интервалы методом Вальда. Оценку безрецидивной выживаемости проводили с использованием лог-рангового теста (log-rank test) для сравнения кривых выживаемости между группами, а также критерия χ² для сравнения множественных групп. Расчет выживаемости проводился на пятый год после проведения операции с учетом цензурированных данных (пациентки, выбывшие из-под наблюдения). Пятилетняя безрецидивная выживаемость рассчитана как наблюдаемая доля выживших пациенток на момент достижения 5-летнего рубежа наблюдения. Продолжительность безрецидивной жизни исчисляли в месяцах с момента проведения операции до времени последнего посещения пациенткой онколога или до выявления исхода (прогрессирование заболевания в виде развития гематогенных метастазов) на этапах динамического наблюдения. Сроки наблюдения за больными составили от 3 до 60 мес. Для всех видов анализа различия принимались статистически значимыми при р<0,05.

Результаты

При анализе клинических данных выявлено, что жалобы на болевой симптом были у 38 (36,9 %), кровянистые выделения из половых путей – у 64 (62,7 %), а эрозия шейки матки – у 72 (69,9 %) больных. Пятилетняя выживаемость составила 85,4 %, медиана общей выживаемости – 57 мес. Значимых корреляций между симптомами (эрозия, боли, кровотечения) и прогнозом заболевания не выявлено. Количество беременностей, родов и абортов также не влияло на исход лечения. Не выявлено значимых различий в показателях 5-летней безрецидивной выживаемости в зависимости от объема лечения, который определялся клинико-морфологическими параметрами (стадия заболевания, размер опухоли, поражение регионарных лимфатических узлов, гистотип опухоли). Полученные данные лишний раз подчеркивают необходимость выявления маркеров прогнозирования риска рецидива и летального исхода у больных РШМ.

При полнотранскриптомном секвенировании опухолевой ткани больных РШМ I–II стадии, получавших адъювантную терапию, обнаружено 1 035 ДЭГ между больными с и без прогрессирования заболевания, включая 448 гипер- и 587 гипоэкспрессирующихся генов. ТОП 70 ДЭГ представлен на рис. 1А. По данным функционального аннотирования ДЭГ при прогрессировании РШМ наблюдается активация метаболических (гипоксия, гликолиз и окислительное фосфорилирование), онкогенных (TNF-α через NFκВ, PI3K/AKT/MTOR, MTORC1, KRAS) и иммунных (ответ на INFγ и INFα, TGF-β и IL2/STAT5) сигнальных путей, а также сигналинга фазы G2/М клеточного цикла через регуляцию активности мишеней транскрипционных факторов E2F и MYC (рис. 1Б).

На основании показателей уровня экспрессии (–2,0>log2FC>2,0) и статистической значимости с поправкой на множественные сравнения

А/А Количество генов Number of genes 47 77 107 137 167

NES

6       1

Б/В

Сигнальный путь регуляции активности мишеней транскрипционного фактора МУС -МУС targets Сигнальный путь TNF-a через NFkB TNF-a signaling via NFkB Сигнальный путь фазы G2/M клеточного цикла -G2M checkpoint

MTORC1 сигнальный путь_ MTORC1 signaling Сигнальный путь регуляции активности мишеней транскрипционного фактора E2F -E2F targets

PI3K/AKT/mTOR сигнальный путь PI3K/AKT/mTOR signaling

Ответ на INFy lnterferon-у response

Ответ на INFa lnterferon-a response

Гипоксия Hypoxia

Окислительное фосфорилирование Oxidative phosphorylation

IL2/STAT5 сигнальный путь IL2/STAT5 signaling "

TGF-р сигнальный путь TGF-p signaling pathway

Гликолиз Glycolysis "

Подавление сигнального пути KRAS KRAS signaling dn

B/C

ITGA6

p-value=0,061

Без прогрессии                Прогрессия

Non-progression                 Progression

макс/тах

Экспрессия Expression level

HACD2

FRMD6

POLD2

FAM83A

ATP5F1C IFI44L UBE2Q2P2 PTP4A2 NDFIP2 BICDL1

C16orf74

KDM5C DSC3 TNFSF10 CCDC14

SH3RF2

DDIT4

PSMB1

PRRG4

FLJ43315 SPATA22 NXF5 WFDC8 CHRNA1 CDH18-AS1 MUCL1 JAKMIP2-AS1 DNAI2 C3orf20 INHBA-AS1 ADGRG7

С12ОГТ50 PCDH10 HRAT17 ZNF534 OOEP C7orf33

UGT3A2 MPP4 ZNF729 MUC5B ASGR2

| Без прогрессии/Non-progression | Прогрессия/Progression

Рис. 1. Транскрипционные особенности РШМ I–II стадии у пациенток с и без прогрессирования заболевания: А – тепловая карта уровня экспрессии генов в ткани опухоли; Б – сигнальные пути, выраженные при прогрессировании заболевания; В – уровень экспрессии гена ITGA6 в ткани опухоли.