Молекулярные показатели, связанные с эффективностью терапии эверолимусом у больных диссеминированным раком почки

Рак почки в большинстве случаев представлен светлоклеточным почечноклеточным подтипом [13], ассоциированным с мутационными изменениями белка Хиппеля – Линдау, увеличением содержания ядерного фактора HIF-1, гиперэкспрессией эндотелиального фактора роста (VEGF), активацией тирозинкиназных путей [16] и ключевой серин/ треониновой протеинкиназы m-TOR [9]. Наиболее эффективным методом лечения метастатического рака почки (мПКР) в настоящее время является таргетная терапия [1, 8]. В клинической практике наряду с тирозинкиназными ингибиторами широкое применение нашли ингибиторы m-TOR, в частности эверолимус («Афинитор», Novartis).

Ведется активный поиск молекулярных маркеров, позволяющих предсказывать эффективность применения данной группы препаратов у пациентов с мПКР, так как существующие широко используемые в клинической практике шкалы Motzer и Heng, включающие в себя только клиниколабораторные параметры, в большей степени позволяют ответить на вопрос, касающийся возможного исхода заболевания [10, 11, 15]. Среди предиктивных маркеров большое значение придается внутриклеточным протеиназам: протеасомам и кальпаинам. Известно, что протеолитическая регуляция содержания молекулярных маркеров, таких как HIF-1, VEGF, m-TOR и др., являющихся основными мишенями таргетных препаратов, может определять особенности прогрессирования заболевания [22]. Активация транскрипционного фактора NF-κB также осуществляется протеасо-мами [12]. В ранее опубликованных работах нами была показана связь экспрессии транскрипционных факторов NF-κB, HIF-1 и ростового фактора VEGF с активностью и субъединичным составом протеасом у больных раком почки при развитии гематогенных метастазов [2–4, 19]. Кроме того, на культуре почечно-клеточного рака показано влияние протеасом на активацию m-TOR сигнального пути [21]. С представленных позиций поиск новых предикторных молекулярных маркеров, сопряженных с эффективностью таргетной терапии мПКР, является актуальным.

Целью работы явилось изучение динамики показателей экспрессии транскрипционных

факторов, сосудистого эндотелиального фактора роста, его рецептора, серин/треониновой проте-инкиназы m-TOR, активности протеасом и каль-паинов у больных с диссеминированным раком почки на фоне проведения таргетной терапии эверолимусом.

Материал и методы

В исследование включено 18 пациентов с гистологически верифицированным диагнозом светлоклеточного рака почки T 2 _— 4 N₁M₁ (средний возраст – 58,6 ± 2,2 года). Все больные имели признаки гематогенной диссеминации с наличием метастазов в печень, легкие и костные структуры (табл. 1). Комбинированное лечение пациентов предполагало проведение предоперационной таргетной терапии эверолимусом в дозе 10 мг ежедневно в течение двух месяцев, с последующим выполнением паллиативной нефрэктомии. Непосредственная эффективность оценивалась на основании результатов клинического обследования, данных СКТ/МРТ по шкале RECIST. Проведение данной работы одобрено этическим комитетом Томского НИИ онкологии.

Материалом для исследования явились образцы опухолевой ткани, полученные при выполнении диагностической биопсии до начала лечения и после хирургического этапа, которые замораживались и хранились при –80°С. В опухолевом материале определяли активность протеасом и кальпаинов, а также количественное содержание VEGF, VEGFR2, HIF-1α, NF-κBp50 и NF-κBp65.

Получение гомогенатов. Замороженную ткань (100 мг) гомогенизировали в жидком азоте, затем ресуспендировали в 300 мкл 50 мМ трис-HCl буфера (pH=7,5), содержащего 2 мМ АТФ, 5 мМ хлорид магния, 1 мМ дитиотреитол, 1 мМ ЭДТА и 100 мМ хлорид натрия. Гомогенат центрифугировали 60 мин при 10000 g и 4°С.

Определение активности протеасом. Химо-трипсинподобную активность протеасом определяли в гомогенатах опухолевых тканей по гидролизу флуорогенного олигопептида N-Succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-Amido-4-Methylcoumarin, утилизирующегося химотрипсинподобными центрами протеасом [6], на флуориметре «Hitachi-850» (Япония) при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 440 нм. Реакционная смесь для определения активности 20S протеасом содержала 20 мМ трис-HCl (pH=7,5), 1 мМ дитиотреитол, 30 мкМ N-Succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-Amido-4-Methylcoumarin. Реакцию проводили при 37°С в течение 20 мин и останавливали 1 % додецил сульфатом натрия. Для оценки активности примесных протеаз в образцах применяли специфический ингибитор протеасом – MG132. Удельную активность протеасом выражали в единицах активности на 1 мг белка.

Определение активности кальпаинов. Активность кальпаинов определяли в гомогенатах тканей таблица 1

клиническая характеристика больных

Показатель Количество больных Пол Муж. 11 (61,1 %) жен. 7 (38,9 %) Средний возраст (мин-макс), 54 ± 1,8 (46–70) лет Местная распространенность Т1 6 (33,3 %) Т2 8 (44,4 %) Т3 3 (16,7 %) Т4 1 (5,6 %) Поражение регионарных лимфоузлов N0 11 (61,1 %) N1 7 (38,9 %) Гематогенные метастазы В легкие 12 (66,7 %) В кости 7 (38,9 %) В печень 1 (5,6 %) В контрлатеральный 1 (5,6 %) надпочечник по методу S. Sandmann [17]. В качестве субстрата использовали тот же флуорогенный олигопептид N-Succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-Amido-4-Methylcou-marin, который был использован для определения активности протеасом. Такая модификация метода S. Sandmann предложена V. Kohli [5, 14]. Реакционная смесь содержала 100 мМ Tris-HCl (pH=7,3), 145 мМ NaCl. Реакцию проводили, добавляя к 30 мкМ Suc-LLVY-AMC, растворенному в реакционной смеси, 5 мкл супернатанта и инкубируя при 25°С в течение 30 мин в присутствии или отсутствие 10 мМ CaCl2 и 0.4 мкМ ингибитора N-ацетил-Leu-Leu-норлейцинал (Sigma).

Определение содержания VEGF, VEGFR2, HIF-1α, NF-κBp50 и NF-κBp65. Образцы осветленных гомогенатов опухолей использовались для определения содержания VEGF, VEGFR2, phospho-m-TOR (R&D Systems, DSL, США), HIF-1α, NF-κB p50 и NF-kB p65 субъединиц (Caymanchem, США) методом твердофазного иммуноферментного анализа на ИФА-анализаторе «Anthos 2020». Приготовление и очистка ядерных экстрактов тканевого гомогената проводились в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя наборов. Уровень белка в гомогенатах и ядерных экстрактах определялся по методу Лоури. Результаты определения содержания VEGF, VEGFR2, phosphor-TOR выражали в пг/мг белка, а HIF-1α, NFκB p50 и NFκB p65 – в условных единицах на мг белка в лунке.

Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета статистических программ Statistica 8.0. В зависимости от вида распределения результаты представлены как m ± M, где m – среднее выборочное, M – ошибка среднего или как медиана с интерквартильным размахом (25-й и 75-й процентили). Значимость различий исследовали с помощью t-критерия Стьюдента или критерия Манна – Уитни.

Результаты и обсуждение

На фоне проведения таргетной терапии клинический эффект был зафиксирован у 14 (78,8 %) пациентов (регрессия опухоли – в 4 (22,2 %), стабилизация процесса – в 10 (56,6 %) случаях. Прогрессирование заболевания зафиксировано в 4 (22,2 %) наблюдениях (табл. 2).

При анализе динамики изучаемых маркеров выявлено, что у больных с наличием ответа на таргетную терапию эверолимусом исходно в опухолевой ткани определялась высокая экспрессия транскрипционных факторов NF-κB p65, NF-κB p50, HIF-1, ростового фактора VEGF и рецептора VEGFR2 по сравнению с пациентами, у которых отмечено дальнейшее прогрессирование заболевания на фоне лечения (табл. 3). У этих же пациентов диагностировано и значимое снижение уровня вышеперечисленных параметров на фоне проводимого лечения. При этом уровень протеинкиназы phospho-m-TOR был исходно низким и оставался таковым после лечения. В 2015 г. J. Dornbusch et al. [7] выявлена прямая корреляция уровня экспрессии vEgFRI, VEGFR2, а также PDGFRa с общей выживаемостью больных, получающих терапию TKI.

Рис. 1. Активность внутриклеточных протеиназ: протеасом (А) и кальпаинов (Б) в опухоли больных раком почки с наличием эффекта таргетной терапии эверолимусом и прогрессированием заболевания.

Примечание: * – значимость различий по сравнению с группой с наличием объективного ответа (частичная регрессия и стабилизация), р<0,05;

# – значимость различий по сравнению с группой больных до лечения, р<0,05

таблица 2 Эффективность таргетной терапии препаратом эверолимус у больных с диссеминированным раком почки

Ответ опухоли

Количество больных

Частичный Стабилизация Прогрессия

4 (22,2 %)

10 (55,6 %)

4 (22,2 %)

таблица 3

содержание транскрипционных факторов nf-κb p65, nf-κb p50, Hif-1α, vegf, vegfr2 и протеинкиназы m-tor в опухоли больных раком почки в зависимости от эффективности лечения по критерию recist

Эффект от лечения	Содержание NF- κ B p65, УЕ/мг белка в лунке тотальная		Содержание NF- κ B p50, УЕ/мг белка в лунке		Экспрессия HIF-1 α , УЕ/мг белка в лунке		Содержание m-TOR, пг/мг белка в лунке		Содержание VEGF, пг/мг белка		Содержание VEGFR2, пг/мг белка
	1	2	1	2	1	2	1	2	1	2	1	2
ЧР +	64,7	5,07	40,6	4,6	16,2	0,73	6,25	7,74	100,5	11,5	85,2	22,6
стабили-	(17,8–	(4,4–	(21,1–	(3,99–	(13,4–	(0,23–	(0,0–	(4,48–	(32,0–	(7,57–	(50,0–	(13,5–
зация	159,0)	10,88)#	189,0)	5,9)#	19,11)*	1,59)#	12,6)	8,6)	344,0)	29,2)#	340,0)	29,5)#
Прогрес-	8,93	6,93	8,85	7,9	4,6	3,56	15,5	12,37	16,2	12,3	41,2	34,0
сирова-	(7,86–	(3,4–	(8,6–	(5,18–	(4,2–	(2,13–	(14,7–	(10,89–	(13,4–	(8,8–	(33,5–	(19,1–
ние	10,0)*	8,43)	9,1)*	8,8)	4,94)*	4,0)	16,43)*	15,85)	19,11)*	15,4)	53,04)*	48,9)

Примечание: 1 – группа больных до лечения; 2 – группа больных после лечения; * – значимость различий по сравнению с группой с наличием объективного ответа (частичная регрессия (ЧР) и стабилизация), р<0,05; # – значимость различий по сравнению с группой больных до лечения, р<0,05.

Полученные результаты позволяют полагать, что существует сопряженность между эффективностью терапии эверолимусом и изучаемыми молекулярными показателями, что делает возможным рассматривать их в качестве дополнительных предсказательных критериев. Представленные данные свидетельствуют о том, что не только уровни транскрипционных факторов NF-κB p65, NF-κB p50, HIF-1, ростового фактора VEGF и рецептора VEGFR2 являются значимыми маркерами, определяющими особенности развития опухоли почки, но важным показателем является и уровень протеинкиназы phospho-m-TOR. Исходно низкое содержание данного показателя до начала лечения эверолимусом связано с более высокой его эффективностью. Аналогичные данные были представлены в работе японских ученых, которые сделали выводы о потенциальной роли phospho-m-TOR в прогнозе эффективности терапии эверо-лимусом [18].

На фоне проведения таргетной терапии также были отмечены существенные изменения в показателях внутриклеточных протеиназ (рис. 1). Так, у больных с клиническим эффектом зафиксировано снижение активности протеасом в 1,8 раза и рост активности кальпаинов в 2,4 раза по сравнению с исходными значениями. При неэффективности тар-гетной терапии эверолимусом и дальнейшем прогрессировании заболевания выявлено повышение