Молекулярный анализ генетического разнообразия популяций донников ( Melilotus dentatus Pers.)

В мировом земледелии донник как кормовая культура играет не столь большую роль в сравнении с другими бобовыми кормовыми травами. Однако к настоящему времени в результате всестороннего изучения у него выявлен комплекс хозяйственно ценных свойств. Так, донник характеризуется высокой засухоустойчивостью и одновременно повышенной зимостойкостью, а также отличается от других бобовых высокой устойчивостью к болезням и вредителям (1). Кроме того, донник зубчатый лучше поедается животными вследствие более низкого содержания кумарина (2). Способность донника произрастать на засоленных землях и солонцах позволяет использовать его для восстановления почв за счет создания солерезистентного бобово-ризобиального комплекса. Соответственно, важная задача при биорекультивационных мероприятиях — увеличение симбиотической эффективности, которая, в свою очередь, в значительной степени зависит от генотипа растения-хозяина.

Специфичность бобово-ризобиального симбиоза обеспечивается обменом сигнальными молекулами между партнерами, в результате чего запускается механизм образования специализированного органа — клубенька. В ответ на выделение корнем растения специфических индукторов — флавоноидов, азотфиксирующие бактерии начинают продуцировать сигнальные молекулы (Nod-факторы), которые инициируют процесс образования клубеньков у бобовых растений (3). Все Nod-факторы представляют собой липохитоолигосахариды. У бобовых растений имеются семь генов, предположительно участвующих в распознавании бактериальных сигналов микросимбионтов и взаимодействии (4). Особенно интересно семейство генов LYK, к которым относятся nfrl и nfr5, впервые выявленные у лядвенца японского (3, 5), SymIO и Sym2 у гороха посевного (3), а также ген NFP у диплоидной люцерны (6, 7). Продукты этих генов, кодирующих LysM-содержащую рецепторную киназу, имеют типичную для растений доменную структуру: внеклеточные LysM-домены, предположительно участвующие в рецепции Nod-фактора, трансмембранный домен и внутрикле- точный домен серин/треонин киназы.

Гены, содержащие LysM -кодирующие участки (LysM -мотивы), относятся к древней и весьма разнообразной группе, распространенной во всех царствах, кроме архей (7). Филогенетический анализ показал, что некоторые последовательности бактериальных LysM -мотивов имеют общие корни с последовательностями у грибов, растений, насекомых и животных. Это позволило предположить, что одна группа таких генов сформировалась перед дивергенцией растительного и животного миров, другая — в результате конвергентной эволюции. Структурное сходство LysM-содержа-щей протеинкиназы с пептидогликаном, представляющим собой один из компонентов клеточной стенки бактерий, служит доказательством участия рецепторных белков NFR1 и NFR5 в распознавании и передаче Nod-фактора на следующие компоненты сигнального каскада, приводящего к образованию клубеньков (7). Однако в настоящее время еще недостаточно знаний, раскрывающих происхождение и механизмы функционирования обсуждаемой группы рецепторных генов.

Существует множество молекулярно-генетических методов, позволяющих исследовать генетическое разнообразие и популяционную изменчивость сельскохозяйственных культур (8). Нашей целью был молекулярный анализ генетической изменчивости у растений донника зубчатого ( Melilotus dentatus Pers.), отобранных в разных географически удаленных районах (Приаралье и Северный Кавказ).

Методика . Семенной материал собирали в период созревания донника зубчатого (октябрь, 2000 год) на территории Республики Казахстан — сайты № 31 (49° 56' с.ш., 58° 92' в.д.) и № 57 (49° 59' с.ш., 57° 71' в.д.), а также в Краснодарском крае России (Северо-Кавказский регион) — сайт № 51 (43° 52’ с.ш., 39° 22 ' в.д.). Семена стерилизовали концентрированной серной кислотой 10 мин, тщательно промывали стерильной водой и проращивали в чашках Петри при температуре 4 °С в течение 2 сут. Для дальнейших исследований из каждой популяции отбирали по 20 проростков.

Геномную ДНК выделяли из 2-суточных проростков методом хлороформной экстракции с использованием CTAB-буфера (9). Растительный материал тщательно гомогенизировали, затем суспендировали в СТАВ и инкубировали при температуре 65 °С в течение 60 мин. После экстракции хлороформом надосадочную жидкость, содержащую ДНК, осаждали равным объемом изопропанола, после чего промывали 70 % этиловым спиртом. Образец ДНК ресуспендировали в 50 мкл деионизированной воды.

Для RAPD-фингерпринтинга (RAPD — random amplified polymorphic DNA) использовали десятичленный праймер FS-27 (5'-AGCCGGCCTT-3') (10). Амплификацию выполняли на термоциклере My Cycler («Bio Rad», США) (денатурация 3 мин при 95 °С; 40 циклов: денатурация — 30 с при 94 °С, отжиг праймеров — 30 с при 37 °С, элонгация — 3 мин при 68 °С; завершающий синтез — 3 мин при 72 °С). RAPD проводили в реакционной смеси объемом 20 мкл, содержащей 10* буфер (670 мМ Трис-HCl, pH 9,1; 166 мМ сульфат аммония, 20 мМ хлорид магния, 0,1 % Твин 20), dNTP (концентрация каждого 0,15 мМ), праймер (15 пМ), 1,5 ед. Taq-полимеразы (UAB «Fermentas», Литва) и 1 мкл геномной ДНК (1012 нг). Продукты амплификации разделяли в 2 % агарозном геле, содержащем бромистый этидий, с 0,5*TAE буфером.

При амплификации ITS региона растительной ДНК использовали праймеры ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') и ITS5 (5'-GGAA-GTAAAAGTCGTAACAAGG-3') (11). Амплификацию проводили в 20 мкл смеси, содержащей 10* буфер, dNTP (концентрация каждого 0,15 мМ), смесь праймеров ITS4 и ITS5 (15 пМ), 1,5 ед. Taq-полимеразы (5 ед/мкл) и 1 мкл геномной ДНК (10-12 нг) на термоциклере My Cycler («Bio Rad», США). Протокол ПЦР: денатурация 3 мин при 95 °C; 30 циклов — 30 с при 95 °C, 30 с при 55 °C, 1 мин при 72 °C; завершающая элонгация 4 мин при 72 °C. Полимеразную цепную реакцию для участка гена nfr5 осуществляли с помощью пары вырожденных праймеров — nfr5-for3 (5'-AAGTCT-TGGTTGTTAYTTGCCA-3') и nfr5-Grev3 (5'-TGCAGTCTCAGCTAATGAA-GTAC-3'). Протокол ПЦР: 3 мин при 95 °C; 30 циклов — 30 с при 94 °C, 30 с при 42 °C, 1 мин при 72 °C; 4 мин при 72 °C.

Для определения нуклеотидной последовательности продукты амплификации ДНК клонировали в векторе pTZ57R/T (UAB «Fermentas», Литва). Cеквенирование выполняли со стандартными праймерами М13 на автоматическом приборе CEQ™ 8000 Genetic Analysis System («Beckman Coulter, Inc.», C0A). Каждую последовательность анализировали в двух направлениях. Данные по определению нуклеотидных последовательностей участков ITS и nfr5 обрабатывали с помощью программного обеспечения секвенатора CEQ™ 8000 Genetic Analysis System. Выравнивание и сборку нуклеотидных и белковых последовательностей проводили с использованием программы Vector NTI Suit 8 (. При построении филогенетических деревьев пользовались программами ClustalX ( и FPQuest («Bio Rad», C0A).

Рис. 1. Расположение мест сбора образцов семян донника Melilotus dentatus Pers., использованных в исследовании.

Результаты . Места сбора образцов донника (номера сайтов) отмечены на рисунке 1.

Для молекулярного изучения генетического разнообразия популяций донника нами использовался комплексный подход, включающий RAPD-анализ, а также определение нуклеотидной последовательности межгенных участков рибосомальной ДНК

(ITS регион). Особое внимание уделялось определению генетического разнообразия рецепторного комплекса гена nfr5 , продукты которого предположительно вовлечены в распознавании ризобиального Nod-фактора.

Начальный этап работы включал выполнение RAPD-фингерприн-тинга, а также анализ растительной ДНК с использованием таксономически значимых участков (ITS). По результатам RAPD-анализа (рис. 2) была построена дендрограмма филогенетического родства изученных образцов донника зубчатого (рис. 3), на которой проявились как внутри-, так и межпопуляционные различия. Популяции донников из Приаральского региона оказались достаточно однородными (за исключением варьирования по минорным фрагментам). При этом популяции растений из Приаралья и с Cеверного Кавказа четко различались, хотя некоторое число образцов имели идентичные RAPD-профили. Для последующего анализа ITS региона и рецепторного участка гена nfr5 из каждой популяции отобрали по три образца Melilotus dentatus Pers. с наиболее полиморфными RAPD-профилями (см. рис. 2).

A

Б

В

Рис. 2. RAPD-фингерпринтинг для образцов из популяций донника Melilotus dentatus Pers., отобранных в Приаралье (A и Б, соответственно сайты № 31 и № 57) и на Северном Кавказе (В, сайт № 51) . М — маркер молекулярных масс 7 /BstEII. Стрелками обозначены RAPD-профили, которые были взяты для последующего анализа ITS региона и рецепторного участка гена nfr5 .

Рис. 3. Дендрограмма филогенетического родства для образцов из популяций донника Melilotus dentatus Pers. (MD) , отобранных на Северном Кавказе (1, сайт № 51) и в Приаралье (2 и 3, соответственно сайты № 31 и № 57) , по данным RAPD-фингерпринтинга.

Секвенированный внутренний транскрибируемый регион (ITS) рибосомальной ДНК включал высококонсервативную последовательность 5,8S-субъединицы РНК и два транскрибируемых участка — ITS1 и ITS2. Такие свойства, как многокопийность, небольшой размер (600-700 п.н.) и согласованная эволюция между локусами ITS1 и ITS2 (11), позволяют использовать эти спейсеры в качестве таксономически значимого молекулярного маркера в систематике высших растений (12).

У исследованных донников нуклеотидные последовательности ITS региона имели размер 687 п.н. На их основании была построена дендрограмма родства растений донника (рис. 4). При этом полученные результаты полностью совпали с данными RAPD-фингерпринтинга. В обоих случаях растения донника из Приаральского и Северо-Кавказского регионов формировали отдельные кластеры, причем степень различий соответствовала обособленности популяций.

Детальный анализ нуклеотидных последовательностей ITS региона выявил точечные замены в регионах ITS1, 5,8S и ITS2 (рис. 5). Особенно интересен участок ITS2, где все три вариабельных сайта с нуклеотидными заменами (позиции 494, 611 и 648) однозначно маркируют отличия северокавказских донников от приаральских. Согласно данным литературы, ITS1 и ITS2 регионы эволюционно сопряжены, то есть генетические изменения должны затрагивать оба спейсера. Однако наши результаты показали, что максимум полиморфных сайтов наблюдается в ITS2 (см. рис. 5).

Рис. 4. Дендрограммы филогенетического родства по ITS региону (внутренний транскрибируемый регион рибосомальной ДНК) и участку гена nfr5 (рецепторный белок NFR5) для образцов из популяций донника Melilotus dentatus Pers. (MD) , отобранных на Северном Кавказе (сайт № 51 — Caucasus 51) и в Приаралье (сайты № 31 и № 57 — соответственно Aral 31 и Aral 57).

ITS1 I 5,8S          ITS2

79 | 160 | 391 | 494 | 611 | 648

Consensus		G	T	A	T	C	A
	3	G	T	A	T	C	A
1	7	G	T	G	T	C	A
	15	G	T	A	T	C	A
	3	G	C	A	T	C	A
2	10	G	T	A	T	C	A
	13	G	T	A	T	C	A
	3	G	T	A	A	T	T
3	10	G	T	A	A	T	T
	12	A	T	A	A	T	T

Рис. 5. Вариабельные позиции в нуклеотидных последовательностях внутреннего транскрибируемого региона ITS рибосомальной ДНК, включающего высококонсервативную последовательность 5,8S-субъединицы РНК и транскрибируемые участки ITS1 и ITS2 регионов, у образцов донника Melilotus dentatus Pers. из разных популяций: 1 и 2 —

Приаралье, сайты соответственно № 31 и № 57, 3 — Северный Кавказ, сайт № 51

(для сайтов указаны номера проанализированных образцов).

Рис. 6. Нуклеотидный полиморфизм доменной структуры рецепторного участка гена nfr5 у изученных растений донника Melilotus dentatus Pers. (независимо от их географического происхождения). LysMl , LysM2 и LysM3 — мотивы гена nfr5 , продукты которых отвечают за связывание бактериального сигнала.

На этапе молекулярногенетического анализа рецепторного гена nfr5 мы провели выравнивание полученных по следовательностей (нуклеотидной и аминокислотной) относительно рецепторного региона гена nfr5 у козлятника восточного. Для популяций донника зубчатого определили доменную структуру изучаемого участка, размер которого составил 778 п.н. Как оказалось, наибольшее число вариабельных сайтов приходятся на LysM-домены: в LysM1 и LysM2 имелись четыре, в LysM3 — три вариабельных позиции (рис. 6, 7).

LysM1                  LysM2               LysM3

1	180 |	198	1 235 I	281	1 359 |	402	\ 448	I 469	536	565	608
Consensus	C	C	G	T	T	A	A	T	T	A	A
3	C	C	G	T	T	A	A	T	T	A	A
1         7	T	T	A	T	T	G	G	C	T	G	G
15	C	C	G	T	T	A	A	T	T	A	A
3	C	C	G	T	T	A	A	T	T	A	A
2      10	C	C	G	T	C	A	A	T	T	A	A
13	C	C	G	T	T	A	A	T	T	A	A
3	C	C	G	C	T	A	A	T	T	A	A
3      10	C	C	G	T	T	A	A	T	C	A	A
12	T	T	G	T	T	G	A	T	T	G	A
Consensus (аминокислота)	-	—	Glu	Ile	Phe	—	—	—	Val	Ser	Asn
Замещенная аминокислота	—	—	Lys	Thr	Ser	—	—	—	Ala	Gly	Ser

Рис. 7. Вариабельные позиции нуклеотидных последовательностей и значимые аминокислотные замены в рецепторном участке гена nfr5 у образцов донника Melilotus dentatus Pers. из разных популяций: 1 и 2 — Приаралье, сайты соответственно № 31 и № 57, 3 — Северный Кавказ, сайт № 51 (для сайтов указаны номера проанализированных образцов).

Анализ аминокислотных последовательностей показал, что в домене LysM1 число сайтов с заменами уменьшилось до 2, в LysM2 — до 1, при этом в LysM3 оно осталось прежним и равнялось 3 (см. рис. 7). Таким образом, обращает на себя внимание LysM3-домен, в котором выявлено повышение частоты несинонимичных (значимых) замен, возможно, указывающих на эволюцию анализируемого гена в рамках движущего отбора с целью создания множества модификаций растительного рецептора при взаимодействии с бактериальным сигналом.

Сопоставление дендрограмм, построенных на основании изучения нуклеотидных последовательностей в рецепторной части гена nfr5 и в ITS регионе (см. рис. 4), показало, что топология дендрограммы nfr5 уже не имеет такого однозначного сходства с RAPD- и ITS-дендрограммами, согласующимися как между собой, так и с географической приуроченностью популяций донника. Вероятно, здесь наблюдается варьирование замен в рецепторном участке гена nfr5 вне зависимости от географического происхождения растений. Возможно, это явление связано с экологической пластичностью донника в изменяющихся условиях среды, его способностью тонко реагировать на бактериальные сигналы (Nod-фактор) и адаптироваться к ним, не исключено также, что мы имеем дело с переносом генетического материала между популяциями.

Итоговые нуклеотидные последовательности участков для ITS и nfr5 у растений донника депонированы в базу данных NCBI под следую щими номерами:

(ITS_69/7-JF461307,     ITS_69/2-JF461308,      ITS_69/13-JF461309,

ITS_57/3-JF461310,    ITS_57/14-JF461311,    ITS_57/10-JF461312,

ITS_51/3-JF461313,   ITS_51/16-JF461314,   ITS_51/15-JF461315,

ITS_31/7-JF461316,   ITS_31/3-JF461317,    ITS_31/15-JF461318);

(NFR5_69/7-JF461295, NFR5_69/2-JF461296, NFR5_69/13-JF461297, NFR5_57/3-JF461298, NFR5_57/14-JF461299, NFR5_57/10-JF461300, NFR5_51/3-JF461301, NFR5_51/16-JF461302, NFR5_51/15-JF461303, NFR5_31/7-JF461304, NFR5_31/3-JF461305, NFR5_31/15-JF461306).

Итак, показано, что между растениями донника зубчатого Melilotus dentatus Pers., произрастающими в разных регионах (Приаралье и Северный Кавказ), имеются различия как на внутри-, так и на межпопуляционном уровне. Кроме того, наблюдается обособленность популяций донника в кластеры согласно их географическому распространению. При этом выявлено независимое распределение популяций по рецепторной части гена nfr5 относительно кластерной структуры по ITS региону. Примененный нами молекулярно-генетический анализ полиморфизма по симбиотическим генам позволяет получать более глубокое представление о биоразнообразии растений из этой хозяйственно значимой группы, необходимое при их использовании как генетических ресурсов в программах по биотехнологиям живых систем. Учитывая интенсивное развитие фундаментальных исследований по симбиогенетике, также интересно проследить коэволюци-онные связи между макро- и микросимбионтами.