Монооксид азота в плазме крови крыс линии «Вистер» при хроническом введении витамина D3

Введение. В последнее время публикуется все больше данных о взаимосвязи витамина D с функционированием эндотелия, являющегося регулятором сосудистого гомеостаза и гемодинамики [1, 2]. Под влиянием различных раздражителей эндотелий высвобождает вазодилататоры (монооксид азота, простациклин, натрийуретический пептид С-типа и др.) и вазоконстрикторы (активные формы кислорода, ангиотензин-2, эндотелин-1) [1, 3]. Среди них монооксид азота (NO) характеризуется наиболее мощным сосудорасширяющим действием, а также является мощным ингибитором агрегации тромбоцитов и адгезии к сосудистой стенке [3, 4]. Дисбаланс в синтезе NO может привести к развитию таких сердечно-сосудистых патологий, как гипертония, ишемическая болезнь сердца и атеросклеротическое поражение сосудов, что в результате может снизить функциональные возможности организма спортсменов [5, 6]. На данный момент существует большое число исследований, доказывающих влияние витамина D и его рецепторов (VDR) на синтез монооксида азота путем геномного и негеномного действия. Показано, что витамин D и его рецеп- торы могут регулировать синтез NO посредством изменения активности эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) [1]. Кроме того, отсутствие VDR приводит к снижению биодоступности L-аргинина из-за повышенной экспрессии аргиназы-2, которая конкурирует с eNOS за L-аргинин [7]. Негеномное действие витамина D может усиливать внутриклеточную активность eNOS через внутриклеточный каль-цийзависимый путь [8]. Увеличение внутриклеточной концентрации кальция способствует образованию комплекса кальций/кальмо-дулин, который играет важную роль в активации eNOS [9]. 1,25(OH)-витамин D может увеличивать продукцию NO в эндотелиальных клетках за счет быстрой негеномной активации эндотелиальной NO-синтазы с помощью VDR-зависимого каскада фосфорилирования [10]. Таким образом, поддержание высокого уровня витамина D является важным условием нормального функционирования эндотелия.

Цель исследования. Изучение влияния потребления витамина D3 в составе эмульсий на степень изменения уровня монооксида азота в крови крыс линии «Вистар».

Материалы и методы. Исследование проводили на половозрелых самцах крыс линии «Вистар» с массой тела 200–300 г (2–3 мес.). Содержание животных в течение 7–10-дневного периода адаптации и во время проведения исследования осуществляли при температуре 21±1 °С и 12-часовом освещении на стандартном рационе вивария с доступом к воде ad libitum. Протокол исследования соответствовал Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей, и был одобрен на заседании комитета по биоэтике Института физиологии Коми НЦ УрО РАН.

По истечении периода адаптации крысы были взвешены и разделены случайным образом на две группы: 1) контрольную (n=6), содержавшуюся в условиях вивария в течение всего эксперимента; 2) опытную (n=6), получавшую эмульсию с витамином D3 ежедневно в течение 30 сут. Животные, вес которых отличался от средней массы тела животных остальной выборки на 10 % (в большую или меньшую стороны), были исключены из экс- перимента. В дальнейшем контроль массы тела осуществляли путем взвешивания животных 1 раз в неделю с целью коррекции содержания витамина D3 в составе эмульсии. Расчет дозы витамина D3 проводили исходя из данных литературы о максимально допустимой терапевтической суточной дозе витамина D3 для человека и формулы расчета биоэкви-валентной дозы вещества с учетом метаболического коэффициента данного вида лабораторного животного. Доза витамина D3 составляла 4000 МЕ.

Эмульсию, содержащую витамин D3, вводили per os в объеме 0,5 мл с помощью зонда из нержавеющей стали (18G×76 мм, диаметр оливы – 2,25) без наркотизации, натощак (для имитации перорального потребления препарата человеком). Выбор объема вводимой эмульсии сделан с учетом рекомендаций отечественных и зарубежных авторов [11, 12], а также данных о том, что маслянистые вещества из-за их удельной массы могут хуже переноситься животными, чем средства, вводимые в виде водного раствора.

Выведение животных из эксперимента осуществляли методом декапитации под легким наркозом (через сутки после последнего введения) в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (приказ № 755 от 12.08.1987) и Федеральным законом «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997.

Уровень витамина D3 в организме оценивали посредством измерения в плазме крови концентрации 25-гидроксивитамина D (25-ОН-витD) и 1,25-дигидроксивитамина D (1,25-ОН-витD) с использованием иммуно-ферментных наборов фирмы «БиоХимМак» (Россия).

Уровень стабильных метаболитов монооксида азота – нитритов (NO 2^- ) и нитратов (NO 3^- ), сумма которых дает показатель стабильных метаболитов NO – (NO x ), определяли в плазме крови колориметрическим методом в реакции с реактивом Грисса [13].

Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения Sta-tistica (версия 6.0, StatSoft Inc., 2001, США). Описательные статистические данные были использованы для расчета средней (M) и ошибки (m). Значимость различий между группами оценивали по критерию Крускала – Уолиса. Коэффициенты корреляции между двумя переменными рассчитывали с помощью рангового анализа Спирмена. Различия считали значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение. Важнейшими формами витамина D в организме являются

25-гидроксивитамин D и 1,25-дигидроксиви-тамин D. Первый из них синтезируется в печени и является транспортной формой витамина D. Второй является основным биологически активным метаболитом, гормональной формой витамина D [14]. Проведенное нами исследование показало значительное увеличение уровня данных форм витамина D в организме крыс (рис. 1).

Рис. 1. Уровень витамина D в контрольной и опытной группах крыс

Fig. 1. Vitamin D level in the control and experimental groups of Wister rats

Согласно литературным данным пероральное введение витамина D приводит к более быстрому, по сравнению с другими способами, увеличению его уровня [15], причем максимальный уровень после однократного введения достигается через 24 ч [16]. Наши исследования показали эффективность 30-дневного приема витамина D3 крысами. Уровень гормональноактивной формы 1,25-ОН-витD был в 6 раз выше контрольного. Концентрация 25-ОН-витD при этом была уже не такой высокой (в 3,1 раза выше по сравнению с кон- трольной группой), что связано, вероятно, с оптимизацией его транспорта в крови.

Значения NO x и NO 2^- в плазме крови крыс опытной группы (NO x – 41,2±1,9 мкмоль/л; NO 2^- – 12,3±0,9 мкмоль/л) были выше, чем в контроле (NO x – 28,3±1,1 мкмоль/л; NO 2^- – 6,9±0,5 мкмоль/л) (p<0,01) (рис. 2). Уровень NO 3^- в плазме крови также имел тенденцию к увеличению, однако статистически значимых различий не выявлено (контрольная группа – 21,4±0,9 мкмоль/л; опытная группа – 28,9±2,07 мкмоль/л).

Контрольная группа – Control group Опытная группа – Experimental group

Рис. 2. Показатели монооксида азота в плазме крови у крыс при введении витамина D3 (** – p<0,01 при сравнении контрольной и опытной групп)

Fig. 2. Nitric oxide level in blood plasma in Wister rats receiving vitamin D3 (** – the differences are significant compared to the control (p<0.01))

Проведенный корреляционный анализ по-   крыс выявил взаимосвязь уровня NOx, NO2- с по

казателей NO и уровня витамина D в крови казателями 25ОН-витD и 1,25ОН-витD (табл. 1).

Таблица 1

Table 1

Коэффициенты корреляции между уровнем стабильных метаболитов монооксида азота и содержанием витамина D3 в плазме крови крыс

Correlation coefficients between the levels of stable nitric oxide metabolites and vitamin D3 in the blood plasma of Wistаr rats

Параметр Parameter	n	Значение коэффициента корреляции (r) Correlation coefficients (r)
		25ОН-витD, пмоль/мл 25OH-vitD, pmol/ml	1,25ОН-витD, пмоль/мл 1.25OH-vitD, pmol/ml
NO x , мкмоль/л NO x , µmol/l	12	0,71**	0,85***
NO 2- , мкмоль/л NO 2- , µmol/l	12	0,70**	0,97***
NO 3- , мкмоль/л NO 3- , µmol/l	12	0,28	0,27

Примечание. Уровни статистической значимости: **p<0,01; ***p<0,001.

Note. ** – the differences are statistically significant (p<0.01); *** – the differences are statistically significant (p<0.001).

Согласно данным литературы монооксид азота – сигнальная молекула, ответственная за вазодилатацию. Она играет важную роль в регуляции кровообращения и артериального давления [17]. Известно, что уровень NO в крови резко снижается у пожилых людей и у пациентов с низким уровнем витамина D [18], ухудшая реакцию кровеносных сосудов. Четырехнедельный прием витамина D в дозе 2000 МЕ/день улучшает реакцию микрососудов у афроамериканцев [19]. Таким образом, витамин D и монооксид азота являются важ-

ными соединениями, имеющими функциональную связь друг с другом. Их оптимальный уровень в организме людей может улучшить здоровье, увеличить аэробную и физическую работоспособность [20, 21].

Заключение. Результаты наших исследований показали, что 30-суточный прием эмульсии с витамином D3 способствует увеличению уровня NO в крови крыс, что может свидетельствовать об интенсификации ферментативного синтеза NO и улучшении эндотелиальной функции.

Работа выполнена в рамках гранта РНФ №19-73-10091 «Эмульсии Пикеринга, стабилизированные анизотропными металлоксид/полисахаридными нанокристаллами: формирование коллоидных систем и их биомедицинские приложения» (рук. – к.х.н. В.И. Михайлов, 2019–2022 гг.).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов

Концепция и дизайн исследования: Бойко Е.Р., Вахнина Н.А., Потолицына Н.Н.

Литературный поиск, участие в исследовании, обработка материала: Паршукова О.И.,

Потолицына Н.Н., Вахнина Н.А., Каликова Л.Б., Иванкова Ж.Е., Алисултанова Н.Ж.,

Третьякова А.М., Черных А.А., Шадрина В.Д.

Статистическая обработка данных: Паршукова О.И., Иванкова Ж.Е., Алисултанова Н.Ж.

Анализ и интерпретация данных: Паршукова О.И., Третьякова А.М., Черных А.А., Шадрина В.Д.

Написание и редактирование текста: Паршукова О.И., Потолицына Н.Н., Бойко Е.Р.