Морфофизиологические эффекты фитогормона эпибрассинолида на позвоночных животных в раннем онтогенезе

Астраханский государственный технический университет

Представленные в работе в обзорном плане экспериментальные сведения являются результатом исследований эффектов действия перспективного биологически активного вещества - представителя класса брассиностероидов - эпибрассинолида на организм животных разного уровня филогенеза. Эпибрассинолид, обладая антиоксидантными свойствами, нормализует ряд морфофизиологических показателей у представителей позвоночных из класса рыб, амфибий, млекопитающих в раннем постнатальном онтогенезе при воздействии токсических агентов.

Современные физиологические исследова ния охватывают широкий спектр проблем , зат рагивающих как существование отдельных ин дивидов , так и взаимоотношения и динамику развития сложных надорганизменных и внутри - организменных структур и функций . В настоя щее время подобные исследования занимают важное место среди других биологических наук [5]. В наши дни , пожалуй , трудно перечислить все главные области и аспекты исследований , затрагивающие процессы становления и преоб разования физиологических процессов , функ ций , ответных реакций животных разных так сономических групп в онто - и филогенезе . Сложная взаимосвязь этих процессов с совре менной окружающей средой постоянно наруша ется в силу целого ряда глобальных причин , ча сто антропогенного происхождения . Живой организм пытается всеми возможными спосо бами компенсировать последствия таких воздей ствий , и в этой борьбе его помощниками высту пают и биологически активные вещества различ ного происхождения как собственные , так и при внесенные из внешней среды . Одной из акту альных проблем современной биологии являет ся изучение морфофизиологических эффектов и механизмов воздействия биоактивных препа ратов на организм различных животных [1].

Антропогенное воздействие становится все более многофакторным; возникает все большее число синергических эффектов, которые, к сожалению, слабо изучены [19, 21, 34]. Несом- ненно, наряду с загрязнением воздушной среды, нарушением экосистем суши сильное негативное воздействие распространяется и на гидросферу. Это относится и к Волго-Каспийскому бассейну [20, 28]. Существует необходимость разрабатывать, внедрять и использовать альтернативные подходы в разведении и сохранении ценных видов животных [27]. Одним из возможных путей повышения выживаемости ценных биологических объектов является применение иммуномодуляторов и биостимуляторов на ранних этапах онтогенеза с целью возрастания сопротивляемости организма к прессу неблагоприятных воздействий окружающей среды.

За последние годы открыт ряд перспективных биологически активных веществ животного и растительного происхождения, созданы новые биоактивные препараты разного назначения и спектра действия, призванные нивелировать определенные нежелательные эффекты и последствия неблагоприятных воздействий среды. Однако потенциальные возможности большинства из недавно открытых биологически активных веществ изучены недостаточно или просто не известны. Это положение в полной мере относится и к сравнительно недавно открытому в США шестому классу фитогормонов ‒ брасси-ностероидов, получивших широкое научнопрактическое направление исследований на растительных организмах в Японии, Китае, Индии, Белоруссии, России и других странах [35, 3941]. Первые поступившие сведения по эффек- там действия представителя класса брассинос-тероидов ‒ эпибрассинолида в виде препаративной формы “Эпин” на животные организмы известны с 90-х годов 20 века и носили поначалу фрагментарный характер [8, 11, 45]. Синтетический фитогормон эпибрассинолид в чистом виде (спиртовой раствор) и в виде препаративной формы “эпин” по эффектам действия на животные организмы разного уровня филогенеза был в числе наиболее малоизученных перспективных веществ. С 1995 года работа по исследованию действия эпибрассинолида на животные организмы разного уровня онто- и филогенеза ведется нами по ряду научно-практических направлений [13, 15, 16, 32].

Эпибрассинолид ( С ₂₈H₄₈O₆) в силу легкой доступности и дешевизны , а также сверхниз кого расхода был использован при проведении ряда успешных производственных проверок на рыбоводных хозяйствах юга России . Более того , преимущественный интерес к дальнейшим ис следованиям именно этого вещества был под креплен данными о его экологической безопас ности и разрешениями для широкого исполь зования в сельском хозяйстве . В 1998 году На учно - исследовательским центром токсикологии и гигиенической регламентации Министерства здравоохранения РФ ( г . Серпухов ) выполнена дополнительная проверка препаратов эпибрас - синолида на мутагенную активность по трем принятым для этих целей тестам , которая еще раз подтвердила его экологическую безопас ность . Этот факт явился , важным моментом в продолжение дальнейших исследований [13].

Основной целью наших исследований было выяснение особенностей физиологических эффектов действия биологически активного вещества ( БАВ ) эпибрассинолида на организмы представителей разных классов позвоночных животных в раннем онтогенезе .

В ходе исследований мы решали следую щие задачи .

• 1.    На основе современных представлений выявить возможные основные направления вли яния биологически активных веществ ‒ брасси - ностероидов на организмы животных разных классов .

• 2.    Охарактеризовать особенности поведен ческих реакций при действии эпибрассинолида

• 3.    Выявить физиолого - биохимические осо бенности влияния эпибрассинолида на рыб , ам фибий , млекопитающих по ряду исследуемых показателей : уровня перекисного окисления ли пидов ( ПОЛ ), проницаемости гематоэнцефали ческого ( ГЭБ ) и некоторых гистогематических барьеров ( ГГБ ), активности каталазы эритроци тов и уровня гемоглобина крови .

• 4.    Изучить и охарактеризовать основные морфофункциональные изменения печени рыб , амфибий , млекопитающих в раннем онтогене зе на фоне действия фитогормона эпибрасси - нолида , экзотоксикантов , а также предваритель ного внесения БАВ с последующим воздей ствием неблагоприятных факторов на организм животных .

у молоди белуги , русского осетра , черноморс кого лосося , чешуйчатого карпа , белого толсто лобика , серебряного карася , озерной лягушки и лабораторных крыс в норме и на фоне действия неблагоприятных факторов .

Объекты исследований в нашей работе в разные годы (1995 ‒ 2002 г.г.) были представлены тремя классами позвоночных животных: рыбы (Pisces), амфибии (Amfibia), млекопитающие (Mammalia). Из великого многообразия рыб данный класс рассмотрен в работе на примере представителей нескольких видов из трех отрядов ‒ древних, однако, нашедших свою четко выраженную эволюционную нишу ‒ осетрооб-разных (Асipenseriformes), отряда лососеобразных (Salmoniformes) и отряда карпообразных (Cypriniformes). Важным элементом в работе явилось рассмотрение действия эпибрассиноли-да на организмы из класса амфибий, где ведущая роль была отведена представителю рода Rana. Исследования действия эпибрассинолида на организм озерной лягушки (Rana ridibunda), повсеместно распространенного универсального объекта физиологических работ, стали логическим продолжением в феноменологическом аспекте. При оценке действия новых биологически активных веществ на позвоночных животных важным вопросом является изучение влияния подобных препаратов на организмы теплокровных животных. Часть экспериментальных исследований морфофизиологического анализа внутриорганизменных структур позвоночных на фоне действия эпибрассинолида нами была про- ведена на лабораторных животных: белых крысах с учетом основных возрастных, половых, сезонных и других особенностей .

Рабочую концентрацию раствора эпибрас - синолида готовили в соответствии с требовани ями разработанного метода экспресс - тестирова - ния [12] из ампулы препарата “ Эпин ” разведе нием в 250 мл физиологического раствора , по лучая маточный раствор с концентрацией 1 мг / л . Затем серией последовательных разведений готовили рабочий раствор 10^-4 мг / л , добавляя его в аквариумы с рыбами из расчета 1 мл / л воды , и , получая окончательную концентра цию 10^-7 мг / л [15], вводили внутрибрюшинно для лягушек и крыс , а также перорально в зависи мости от условий постановки экспериментов [13]. Рабочие концентрации ( дозы ) и время воз действия каждого из использованных в работе токсических агентов ( сульфата меди , фенола , де тергентов и др .) подобраны эмпирическим пу тем и на основе существующих исследований [18, 26], а также исходя из продолжительности эксперимента , возраста животных , массы их тела и DL₅₀ [7, 24].

Исследования выполнены в Межкафед ральной лаборатории экологических и техноло гических проблем осетроводства Астраханско го государственного технического университе та ( АГТУ ), в лаборатории физиологии Астрахан ского государственного университета ( АГУ ), на производственных участках Кизанского осетро вого рыбоводного завода ( КОРЗ , Астраханская область ) и на Адлерском производственно - экс периментальном рыбоводном лососевом заво де ( АПЭРЛЗ , Краснодарский край ).

Комплексный подход к изучению действия фитогормона эпибрассинолида на физиологи ческое состояние животных в раннем онтогене зе определил необходимость использования раз нообразных физиологических , а также некото рых морфологических и биохимических при емов исследования [14, 15, 17, 22, 25, 30]. Все полученные в работе экспериментальные дан ные обрабатывали статистически [6, 29].

На основании проведенных исследований нами был выявлен ряд особенностей действия данного БАВ как распространенного представи теля класса брассиностероидов .

По основному механизму действия на внут- риорганизменные и внутриклеточные системы животных фитостероид эпибрассинолид, исходя из его химического строения и основных известных на сегодня день функций, имеет ряд сходных свойств с аналогичными по структуре стероидными гормонами животного и растительного происхождения [38-44]. Это еще раз свидетельствует об общности природы стероидных гормонов данного ряда растительного и животного происхождения и, по-видимому, объясняет, исходя из известных механизмов действия, наблюдаемые эффекты не только на растительных организмах [31, 36], но и на животных разных классов [12, 13]. Локализуясь в ростовой части молодых побегов большинства съедобных растений и пыльце брассиностероиды проникают в организм беспозвоночных [35] и позвоночных животных [9, 12, 13], вызывая, по всей видимости, различные видоспецифичные и общие протектирующие эффекты [15, 23, 37]. Вспомним, к примеру, структурную и функциональную близость брассиностероидов с экдистерои-дами. Сходные производные найдены в мице-лиях некоторых грибов, папоротниках, корнях, листьях, цветках ряда видов высших растений [35].

В работе с подобными веществами боль шое значение имеют правильно подобранные концентрации . При работе с эпибрассинолидом , следует также учитывать , что его производство развивается , и поэтому каждый год оно стано вится все более совершенным , а препараты - более активными . Имеются показатели качества на некоторые из использованных препаратов , однако , тестирование их активности проводи лось , как правило , только при помощи тестов на растительных , а не животных объектах ([42, 43]. Не случайно для выявления оптимальных кон центраций каждой новой партии нами была про ведена серия работ на разных видах животных с препаратами разных годов выпуска [12, 13, 15].

Различные партии препаратов, в основе которых содержится эпибрассинолид, нуждаются в предварительном экспресс-тестировании на адекватно реагирующих биологических объектах в силу возможного наличия примесей и ингибирующих биологическое действие стереоизомеров . Обоснование выбора объекта в качестве возможного биотеста должно быть связано с реальными качественными и количественными изменениями по ряду морфофизиологических показателей и возможности проведения статистического анализа [13].

На основе исследований по выявлению оптимально действующих концентраций разных партий коммерческого препарата “ Эпин ”, глав ной составной частью которого является фито стероид эпибрассинолид , нами были предложе ны различные экспресс - тесты оценки активно сти новых партий . Это было так же важно для выяснения роли данного БАВ при воздействии неблагоприятных факторов среды на клетки животных организмов . Так , появился экспресс - тест для оценки активности разных партий пре парата и выявления оптимально действующих рабочих концентраций на сперматозоидах рыб : осетровых , лососевых , карповых , и разработа но устройство для одновременного тестирова ния разных партий сперматозоидов животных . Позже нами были проведены исследования на криоконсервированных половых клетках осет ровых рыб , что позволило выявить криопротек торные свойства изучаемого вещества . На спер матозоидах в силу некоторых технических при чин невозможно на ряде экспериментальных объектов в полном объеме работать круглогодич но , что приводило к сезонности исследований . Как возможная попытка избежать эксперимен тальные неудобства , а также провести реальную оценку на типичном повсеместно распростра ненном объекте из микроорганизмов ‒ сенной палочке (Bacillus subtilis) нами были проведены серии экспериментов по оценке разных партий препарата на фоне токсического действия диэ таноламина . На основании полученных значе ний было показано , что разрабатываемый спо соб тестирования биологической активности различных препаратов , содержащих в основе эпибрассинолид , на данных микроорганизмах в присутствии токсикантов был реально обосно ванным [13, 15].

Гормоны влияют на поведение различными путями. Существуют всевозможные механизмы, посредством которых гормоны могут изменять поведение. Стероидные гормоны действительно оказывают глубокое влияние на развитие нервной системы на поздних этапах эмбриогенеза. Однако данных, которые указывали бы на то, что развитие новых нервных связей под влиянием гормонов является фактором, определяющим изменение в поведении у животных на других этапах онтогенеза, очень мало [33].

Проведенные исследования нескольких видов неполовозрелых позвоночных животных еще более дополнили существовавшие представ ления о возможных проявлениях поведенческих реакций , определяемых гормонами . Нами сде лана попытка показать возможные проявления поведения животных на фоне неблагоприятных факторов среды при предварительном внесении эпибрассинолида , имеющего повсеместное рас пространение в растительном мире , и без экзо - токсических воздействий . В своей работе мы попытались провести некоторые методически сходные исследования оценки поведенческих ре акций неполовозрелых животных на фоне дей ствия эпибрассинолида и неблагоприятных фак торов среды на следующих видах : рыбы ‒ белу га , русский осетр , черноморский лосось , чешуй чатый карп , белый толстолобик , серебряный ка рась ; амфибии ‒ озерная лягушка ; млекопита ющие ‒ беспородные белые крысы одного пола и возраста .

Так, выявлено, что предварительная обработка молоди белуги эпибрассинолидом (10-7 мг/л, 1 час до помещения в экспериментальные бассейны с различными гидрохимическими условиями) увеличивала выживаемость и улучшала показатели деятельности центральной нервной системы молоди, приближая их к контрольным значениям. Поведение неполовозрелых особей черноморского лосося при оценке активности и выработке условного рефлекса свидетельствует о явлении доместикации в случае искусственного выращивания . В случае использования эпибрассинолида на молоди карпа отмечены протекторные свойства (примененного способа обработки) эпибрассинолидом, приближение показателей реактивности, измененных под влиянием температурных и гидрохимических условий, к контрольному уровню . Для молоди толстолобика выявлены воздействия, приводившие к изменениям, сказавшимся на становлении и развитии условно-рефлекторной деятельности, и связанные с воздействием на молодь (по убывающей): раствора фенола, детергента, сульфата меди. В целом, в такой же пос- ледовательности проявились токсико-протекторные свойства эпибрассинолида. Как показали обобщенные результаты работ по оценке двигательной активности серебряного карася и способности особей к проявлению условно-рефлекторной деятельности, получены достоверные сведения об улучшении анализируемых поведенческих параметров у животных, содержавшихся в токсической среде в случае предварительного воздействия эпибрассинолидом. Эффекты приближения показателей двигательной активности к контролю после предварительной обработки эпибрассинолидом и проявления условно-рефлекторной деятельности для озерных лягушек оказались более выраженными при воздействии токсикантов органической природы. Проведенное изучение действия эпибрассинолида в условиях хронической интоксикации неполовозрелых и половозрелых крыс позволило выявить протектирующее влияние этого вещества на поведенческом уровне. Применение фитостероида эпибрассинолида на ранних этапах онтогенетического развития животных разных классов, видов и экологических групп на фоне действия экспериментальных факторов различной природы (абиотических, токсических) в большинстве случаев ведет к стабилизации ряда параметров показателей активности, в том числе в случае длительного воздействия неблагоприятной среды. Введение рассчитанных доз “Эпина” в целом способствует успешной выработке новых простых условных рефлексов различной структуры у неполовозрелых крыс.

Учитывая специфику действия подобного типа веществ, мы провели исследования некоторых физиолого-биохимических показателей жизнедеятельности организмов разных систематических групп. Анализы перекисного окисления липидов (ПОЛ), проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и гистогематичес-ких барьеров (ГГБ), а также некоторых биохимических параметров крови свидетельствуют об отсутствии реальных патологических изменений и проявлений в случае проникновения эпибрас-синолида в организм позвоночных животных разных классов в период раннего онтогенеза. Биологически активное вещество эпибрассино-лид в силу наличия антиоксидантных свойств в ряде случаев способствует стабилизации, при- ближению к контрольному уровню целого комплекса физиологических параметров у позвоночных животных в раннем онтогенезе (стабилизируя барьерные структуры ГЭБ и ГГБ) в случае пребывания особей в неблагоприятных условиях окружающей среды или при экспериментальных воздействиях токсических веществ разной природы.

Затрагивая широкий аспект исследований ферментативной активности , мы попытались на примере фермента каталазы эритроцитов крови проанализировать по скорости разложения суб страта возможные изменения , произошедшие на ферментативном уровне вследствие проникно вения во внутреннюю среду организма стерои да растительного происхождения . Отмеченные особенности указывают на общность проявле ния действия эпибрассинолида по отношению к уровню активности данного фермента на жи вотных разных классов в условиях токсических нагрузок . Выявлены и охарактеризованы ниве лирующие эффекты при предварительном вне сении эпибрассинолида в случае существенных воздействий на функциональную активность этого фермента в условиях длительных токси ческих нагрузок . Интересным аспектом остают ся подобные исследования при различных тем пературных условиях .

Сравнительный анализ морфофункцио нального состояния такого важного органа в об менных процессах животного организма и всей его жизнедеятельности , как печени , позволил значительно дополнить имеющиеся сведения и представления о свойствах и направлениях дей ствия эпибрассинолида на клеточном и внутри клеточном уровнях . Выявлено увеличение фун кциональной активности гепатоцитов в случае внесения эпибрассинолида в ранее рассчитан ных оптимальных концентрациях . Эксперимен тально установлено , что такие животные ( и рыбы и лягушки и крысы ) успешно пережива ли воздействие неблагоприятных условий внеш ней среды и продолжали жить после окончания опыта на протяжении всего периода дальнейших экспериментальных исследований . Следует по лагать , что отмеченные морфофункциональные явления связаны с усилением функциональной активности органа в плане адаптационно - при способительных реакций организма .

Мы приводим некоторые , на наш взгляд , перспективные с различных позиций направле ния дальнейших исследований действия брас - синостероидов на животных .

Интересным и пока открытым остается вопрос о роли брассиностероидов в половом поведении и созревании генеративных клеток животных . Данные исследования , возможно , могут иметь продолжение в русле широко изве стных и хорошо зарекомендовавших исследова ний гормональной регуляции репродуктивной функции рыб [2, 3, 4, 10].

Изучение влияния брассиностероидов ( и эпибрассинолида в частности ) на организмы теплокровных и холоднокровных животных в период старения ‒ целое направление интерес ных и перспективных с практических позиций исследований .

Изучение действия эпибрассинолида и дру гих брассиностероидов на функции и структур ные особенности эндокринных желез в организ ме теплокровных и холоднокровных животных и их влияния на секрецию ( особенно в случае выработки стероидных гормонов ) в различных экспериментальных условиях позволило бы де тально проанализировать отмечаемые в экспе риментах достоверные изменения функциони рования разных систем и органов .

Результаты настоящей работы свидетель ствуют о возможности внедрения , практичес кого использования биологически активного ве щества - эпибрассинолида в виде препарата “ Эпин ” на рыбоводных заводах . В настоящее время препарат успешно применяют на двух рыбоводных хозяйствах : в Краснодарском крае на лососевых видах и Астраханской области на осетровых с целью повышения выхода рыбовод ной продукции , защиты эмбрионов , личинок и молоди от неблагоприятных экологических воз действий и снижения количества производите лей ценных видов рыб , используемых для полу чения плановой продукции .