Морфофизиологические особенности проростков пшеницы (Triticum aestivum L.) при воздействии наночастиц никеля

Нанотехнологии находят широкое применение в промышленности, медицине и сельском хозяйстве. Однако некоторые компоненты нанотехнологических производств потенциально опасны для окружающей среды, а их влияние на биологические объекты недостаточно изучено (1). Вопрос о воздействии наночастиц на живые организмы связан с исследованием механизмов их токсического эффекта и круговорота в природе. По современным представлениям, сложность взаимодействия зависит как от физико-химических свойств, способа получения, размеров, структуры наночастиц, так и от особенностей биологических объектов, в том числе видов растений (2).

Показано, что вещества в форме наночастиц имеют иные свойства и способность проникновения в растения, чем те же вещества в ионной форме (3). Наночастицы металлов характеризуются избыточной поверхностной энергией и высокой реакционной способностью, активно вступают в процессы агрегации и реакции с другими химическими соединениями (4). Кроме того, взаимодействуя с различными структурами клетки и обладая пролонгированным действием, наночастицы могут выступать в роли катализаторов в реакциях с образованием как стимуляторов роста и развития, так и ингибиторов (5, 6). То есть растительные организмы дают возможность оценить специфичность воздействия наночастиц и их дозозависимые эффекты.

К настоящему времени в большей степени изучено влияние на растительные объекты наночастиц Аg, TiO2, Al2O3, Fe2O3, ZnO и CeO2 (7). Сведений о действии наночастиц никеля существенно меньше (8-10). Вместе с тем имеется достаточное количество публикаций по влиянию ионов никеля на рост, развитие и физиолого-биохимические параметры растений (11, 12). По объему производства однородных порошков металлов с высокой степенью чистоты, наряду с наночастицами железа, алюминия, меди и титана, к пятерке лидеров относятся наночастицы никеля (13). Они широко используются в медицине и биологии (14, 15), входят в состав магнитных жидкостей и катализаторов, применяются для создания высокоскоростных оптических устройств (16, 17), а также могут попадать в окружающую среду в процессе производства, использования и утилизации (18).

Никель считают необходимым для высших растений ультрамикроэлементом, поскольку от его содержания зависит активность ферментов различных путей метаболизма, например уреазы. Низкие концентрации солей никеля, внесенные в питательный раствор, оказывают положительное влияние на рост и развитие растений, в том числе пшеницы (19). Среди тяжелых металлов никель выделяется высокой токсичностью и вызывает значительные нарушения структуры и функционирования клеток (20).

В настоящей работе впервые показано, что действие даже низких концентраций наночастиц никеля ( Δ ₅₀ = 5 нм) в диапазоне 0,01-10 мг/л вызывает заметные изменения структурных и функциональных показателей проростков пшеницы и имеет в основном дозовую зависимость.

Цель нашей работы состояла в выявлении морфологических и физиолого-биохимических особенностей у проростков пшеницы под влиянием наночастиц никеля (НЧ Ni0) разной концентрации.

Методика. В качестве объекта исследования использовали 10-суточные проростки мягкой яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Новосибирская 29. Растения выращивали в лабораторных условиях в климатической камере («Labline Scientific Instruments», Польша) при 12-часовом фотопериоде, температуре 23-24 °С и освещенности 60 Вт/м2. В опыте использовали семена, всхожесть которых была определена предварительно по ГОСТ 12038-84 и составляла не менее 95 %. Откалиброванные семена предварительно проращивали в течение 2-3 сут (до появления корешков) в одноразовых пластмассовых чашках Петри с двумя слоями увлажненной фильтровальной бумаги, в опыте использовали суспензии наночастиц Ni0 в концентрации 0,01; 0,1; 1 и 10 мг/л, в контрольном варианте — дистилли- рованную воду. Проросшие семена переносили в вегетационные сосуды объемом 500 мл, которые помещали в климатическую камеру, где проростки выращивали до 10-суточного возраста. В опытных вариантах для выращивания использовали суспензии наночастиц никеля указанных выше концентраций, в контроле — дистиллированную воду. В связи с агрегацией наночастиц и снижением их концентрации в свободной форме ежедневно заменяли все дисперсные системы в сосудах. В каждом сосуде было 25 растений, эксперимент проводили в 4 повторностях для каждого варианта опыта.

Наночастицы Ni⁰ получали методом лазерной абляции в дистиллированной воде из брусков никеля (чистота 99,95 мас.%, марка Ni 3N5) («Гирмет», Россия). При воздействии на брусок излучением импульсного Nd-YAG-лазера LS-2134UTF («Lotis Tii», Белоруссия, Япония) происходила абляция и разбрызгивание материала мишени в окружающую среду. Толщина удаляемого за импульс слоя была мала и не превышала нескольких десятков нанометров. Вне мишени удаляемый материал организовывался в наночастицы (21). По данным просвечивающей электронной микроскопии (Philips CM-12, «Koninklijke Philips N.V.», Нидерланды), диаметр частиц составлял 2-12 нм со средним размером Δ ₅₀ = 5 нм и удельной поверхностью 30 м²/г. Необходимые концентрации дисперсных систем НЧ Ni⁰ получали разведением исходной дисперсионной среды (ДС) дистиллированной водой и последующей 45-минутной обработкой ультразвуком с частотой 35 кГц в ультразвуковой ванне (УЗВ-5,7/1 ТТЦ, ЗАО ПКФ «Сапфир», Россия). Количественные характеристики поглощения наночастиц из ДС определяли методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой по содержанию Ni в образцах тканей из корней и надземной части (листья + стебель) растений (22). Корни перед высушиванием дважды промывали 0,01 % раствором Na-EDТА, затем трижды дистиллированной водой для удаления частиц, сорбированных на поверхности. Образцы корней и листьев, высушенные до постоянной массы, растирали в фарфоровой ступке, для анализа брали навеску массой 0,1 г. Пробы озоляли в микроволновой системе разложения Speedwave TM MWS-3+ («BERGHOF Products + Instruments GmbH», Германия) и анализировали на масс-спектрометре ELAN DRC-e («PerkinElmer, Inc.», США).

Морфометрические параметры оценивали по длине корневой системы и проростков, массе корневой и надземной частей растений. Сырую массу определяли стандартным весовым методом. Для оценки содержания фотосинтетических пигментов формировали среднюю пробу из 10 растений (масса навески 0,4 г). Количество хлорофиллов и каротиноидов определяли спектрофотометрически (спектрометр UV-1601PC, «Shimadzu Corp.», Япония) в спиртовых вытяжках (23). Для измерения интенсивности фотосинтеза и транспирации использовали портативный инфракрасный газоанализатор Li-6400 («LI-COR Biosciences», США) с открытой системой, где в качестве искусственного источника света применяли систему фотодиодов (6400-02B LED), обеспечивающую освещенность 1000 мкмоль^м ^{- 2}^с ^{- 1}. В листовой камере поддерживалась температура 24 °С, скорость потока СО₂ составляла 400 мкмоль/с, его содержание — 400 мкмоль/моль. Интенсивность фотосинтеза и транспирации измеряли в листьях 10-суточных проростков. Содержание флавоноидов оценивали спектрофотометрическим методом по реакции с хлоридом алюминия. Оптическую плотность раствора определяли при X = 415 нм на спектрофотометре UV-1601PC («Shi-madzu Corp.», Япония). Количество флавоноидов рассчитывали по калибровочной кривой, построенной по рутину («Sigma», Великобритания) (24).

Содержание свободного пролина в побегах оценивали с помощью кислого нингидринового реактива по методу L.S. Bates с соавт. (25).

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета Statistica 8 («StatSoft, Inc.», США). В таблицах и на рисунках представлены средние арифметические значения ( M ) и их стандартные ошибки (±SEM) по морфологическим параметрам из 100, по физиолого-биохимическим показателям и накоплению никеля — из 4 биологических повторностей. Достоверными считали различия с вероятностью ошибки р ≤ 0,05.

Результаты. При 10-суточном выращивании пшеницы на дисперсионной среде, содержащей НЧ Ni⁰ в концентрации 10 мг/л, происходило значительное накопление наночастиц в органах растений, особенно в корневой системе. Так, в опытном варианте содержание никеля в корнях составляло 50,89±1,67 мкг/г сухой массы, в контроле — всего 3,8±0,15 мкг/г сухой массы. В надземной части содержание никеля было на порядок ниже: в опыте — 14,20±2,38, в контроле — 0,87±0,025 мкг/г сухой массы.

Рис. 1. 10-Суточные проростки мягкой яровой пшеницы ( Triti-cum aestivum L.) сорта Новосибирская 29 при действии наночастиц Ni⁰ в разной концентрации: К — контроль; 1 — 0,01; 2 — 0,1; 3 — 1; 4 — 10 мг/л в дисперсионной среде (лабораторный опыт).

Аккумулированные наночастицы вызывали видимые изменения морфометрических параметров корневой системы и надземной части проростков пшеницы (рис. 1). Если НЧ Ni0 в концентрациях 0,01 и 0,1 мг/л не изменяли или даже стимулировали ростовые процессы, то НЧ Ni0 в более высоких дозах (1 мг/л и особенно 10 мг/л) значительно угнетали рост корней и надземной части (табл. 1). Так, длина корневой системы при концентрации НЧ Ni0 1 мг/л уменьшилась примерно в 2 раза, а при 10 мг/л — в 3 раза, сырая масса — соответственно в 1,9 и 2,7 раза, длина проростков — в 1,3 и 1,9 раза.

D.F. Piccini с соавт. (11) также показали, что внесение в почву наночастиц никеля размером менее 100 нм в концентрации 100 мг/кг оказывало токсическое влияние на рост корней Le-pidium sativum L. В опытах на Solanum lycopersic-um L. выявлено, что наночастицы никеля размером 28 и 62 нм накапливаются в основном в корнях, уменьшают надземную сухую массу и влияют на содержание Ca и К в листьях (9).

1. Морфометрические параметры проростков мягкой яровой пшеницы ( Triticum aestivum L.) сорта Новосибирская 29, выращенных на дисперсионной среде, которая содержала наночастицы никеля в различной концентрации ( M ± m ; лабораторный опыт)

Концентрация наночастиц, мг/л	Корень		Надземная часть
	длина, см	сырая масса, мг	высота, см	сырая масса, мг
Контроль	7,79±0,22	98,6±4,2	16,83±0,39	221,5±8,5
0,01	9,73±0,23*	129,7±6,4*	17,35±0,21	255,1±7,3*
0,1	8,33±0,16	112,6±8,2	17,02±0,19	233,1±10,2
1	4,12±0,07*	52,8±5,1*	12,89±0,28*	171,8±9,3*
10	2,56±0,07*	36,0±7,2*	8,03±0,34*	121,6±10,3*
*р ≤ 0,05 по сравнению с контролем.

Ингибирование роста корня — одна из наиболее ранних ответных реакций на действие тяжелых металлов (26). Эта особенность широко используется для оценки степени их токсичности в различных концентрациях (27). Защитные механизмы и барьеры, функционирующие на уровне клеток и тканей корня, уменьшают попадание тяжелых металлов в побеги, в результате чего корни накапливают их в значительных количествах, что сказывается на развитии и формировании корневой системы (28, 29).

Аккумулированные НЧ Ni0 оказывали влияние не только на ростовые параметры, но и на физиолого-биохимические показатели листового аппарата проростков пшеницы. В частности, при культивировании проростков на дисперсионной среде, содержащей НЧ Ni0, количество хлорофиллов а и b при концентрации НЧ Ni0 0,01 мг/л незначительно увеличивалось. С повышением концентрации наночастиц наблюдали снижение этого показателя. Статистически достоверно (p < 0,05) содержание хлорофиллов уменьшалось только при концентрации НЧ Ni0 10 мг/л: — на 30 % относительно контроля (рис. 2). Подобные изменения были обнаружены нами ранее при воздействии на пигментный комплекс пшеницы наночастиц платины (30). Количество каротиноидов при дозах НЧ Ni0 0,1 и 1 мг/л снижалось на 19-20 %, при 10 мг/л — на 35 % (см. рис. 2).

Рис. 2. Содержание хлорофиллов a (А) и b (Б) , а также суммы каротиноидов (В) в листьях мягкой яровой пшеницы ( Triticum aestivum L.) сорта Новосибирская 29 в зависимости от концентрации наночастиц (НЧ) Ni⁰ в дисперсионной среде (лабораторный опыт) .

* Различия с контролем статистически значимы при р ≤ 0,05.

Концентрация НЧ Ni°, мг/л

Рис. 3. Интенсивность фотосинтеза (А) и транспирации (Б) листьев у мягкой яровой пшеницы ( Triticum aestivum L.) сорта Новосибирская 29 в зависимости от концентрации наночастиц (НЧ) Ni⁰ в дисперсионной среде (лабораторный опыт) .

* Различия с контролем статистически значимы при р ≤ 0,05.

Показано, что содержание фотосинтетических пигментов уменьшается при действии большинства стрессовых факторов (19, 31). Например, обработка семян T. vulga-re L. наночастицами никеля диаметром 57 нм и последующая 48-часовая инкубация с использованием их растворов в концентрациях 0,0125-1 М вызы- вали резкое уменьшение количества хлорофилла b в листьях и приводили к увеличению содержания малонового диальдегида в корневой системе растений. Это свидетельствует о развитии цитогенетических повреждений за счет окисления липидов клеточных мембран. Наблюдалась также дозовая зависимость (10).

Особенности накопления фотосинтетических пигментов под воздействием НЧ Ni0 в целом были сходны с закономерностями роста проростков (см. табл. 1). Это, вероятно, обусловлено тесной взаимосвязью между фотосинтезом и ростовыми процессами, которые регулируются метаболическими и гормональными механизмами (32).

Исследование интегральных функциональных характеристик листового аппарата — фотосинтеза и транспирации также выявило дозозависимый эффект. Наночастицы никеля в низкой концентрации (0,01 и 0,1 мг/л) достоверно (p < 0,001) повышали интенсивность фотосинтеза, в концентрации 1 мг/л не изменяли этот показатель, и только при 10 мг/л он снижался на 15 % относительно контроля (рис. 3, А). При измерении интенсивности транспирации обнаружили аналогичную зависимость (см. рис. 3, Б).

2. Биохимические показатели у проростков мягкой яровой пшеницы ( Triticum aestivum L.) сорта Новосибирская 29, выращенных на дисперсионной среде, содержащей наночастицы никеля в разной концентрации ( M ±SEM; лабораторный опыт)

Концентрация Сумма флавоноидов Содержание пролина

наночастиц, мг/л	мкг/г сухой массы	к контролю, %	мг/г сухой массы	к контролю, %
Контроль	28,11±0,11	100	0,77±0,12	100
0,01	17,24±0,13*	61	0,95±0,09*	123
0,1	7,03±0,01*	25	1,15±0,21*	149
1	21,22±0,01*	75	1,28±0,25*	166
10	10,17±0,03*	36	1,79±0,26*	232

* Различия с контролем статистически значимы при р ≤ 0,05.

Известно, что при неблагоприятных воздействиях стрес-протекторную функцию выполняют флавоноиды (33) и пролин (34, 35), которые способны связывать ионы металлов с переменной валентностью и тем самым ограничивать неферментативные свободнорадикальные процессы.

В наших экспериментах сумма флавоноидов снижалась с повышением концентрации НЧ Ni0, однако четкой дозовой зави- симости не наблюдалось (табл. 2). Данные литературы относительно изменения содержания флавоноидов при воздействии наночастиц на растения довольно противоречивы. Так, при выращивании Raphanus sativus L. в почве, обработанной наночастицами оксида цезия разной концентрации, отмечали значительный разброс данных в вариантах опыта, поэтому различия были недостоверны (36). Под влиянием наночастиц серебра у Calendula officinalis L. обнаружено снижение количества флавоноидов в разных органах (37). В работе C. Krishnaraj (38), наоборот, показан сдвиг в сторону вторичного метаболизма и увеличение содержания флавоноидов у растений Bacopa monnieri L. под влиянием наночастиц серебра.

В то же время воздействие наночастиц никеля обусловило повышение (p < 0,05) количества пролина в листьях пшеницы относительно контроля, при этом наблюдалась дозовая зависимость от концентрации наночастиц (см. табл. 2), что согласуется с существующими представлениями о протекторной роли пролина при стрессе (34).

Таким образом, выявлены морфофизиологические особенности проростков пшеницы при их выращивании на водных дисперсных системах, содержащих наночастицы никеля (Δ50 = 5 нм). При этом для большинства изученных показателей (морфометрических параметров, содержания хлорофиллов, интенсивности фотосинтеза и транспирации) наблюдалась сходная зависимость: увеличение при малых и отчетливое снижение при более высоких концентрациях НЧ Ni0. Среди соединений, выполняющих защитную функцию, прямо пропорциональное увеличение содержания при возрастании концентрации НЧ Ni0 наблюдалось только по пролину, в то время как для каротиноидов и флавоноидов было показано уменьшение количества. Это позволяет предположить, что в зависимости от концентрации НЧ Ni0 оказывают избирательное действие на различные звенья метаболизма. Полученные результаты могут дополнить данные об обосновании допустимых уровней загрязнения наночастицами металлов растительных организмов и агроценозов, а также использоваться

для разработки практических рекомендаций по диагностированию негативного воздействия НЧ Ni0 на растения.