Морфофункциональная характеристика суставного хряща наружного мыщелка бедра при удлинении голени собак

По литературным данным известно, что регулирующая роль механических факторов особенно существенна в отношении суставных хрящей, для которых механическая функция является главной [12, 18]. В настоящее время широко используются методики удлинения конечностей по Илизарову, при этом происходит вынужденное ограничение движений с созданием постоянного дополнительного давления в суставах [17]. Г.А. Илизаровым открыто неизвестное ранее явление активизации роста и регенерации тканей под влиянием напряжения растяжения, создаваемого в них с помощью дистракционного аппарата [9]. Напряжение растяжения в тканях при удлинении конечности играет адаптогенную роль в восстановлении физиологической функции хряща: пролиферативный потенциал и уровень генной экспрессии дифференцированных клеток при дистракционном остеосинтезе существенно выше, чем при иммобилизации сустава [3]. В исследованиях, проведенных в РНЦ «ВТО», отмечены нарушения архитектоники суставного хряща, структуры и биосинтеза основных его компонентов, регистрируются деструктивные изменения [4, 5, 7]. При гистохимическом изучении гликозаминогликанов суставного хряща использовали по-луколичественные методы, количество осадка красителя оценивали визуально в баллах [10].

В то же время работы по морфологии суставного хряща в условиях дозированного растяжения голени единичны, также в доступной литературе мы не встретили исследований, проведенных с помощью современных методов ко-

МАТЕРИАЛ

Нами изучен суставной хрящ наружного мыщелка бедра 21 беспородной собаки I категории (длина голени 18-21 см) в возрасте 2-3 лет с массой тела 18-25 кг. Три интактные собаки составили контрольную группу. В опытных сериях после закрытой флексионной остеоклазии берцовых костей в течение 4-х недель осуществляли дозированное удлинение правой голени с темпом 1 мм в день (с 8 до 20 часов) за 60 приемов – автодистракция (1 серия, 9 животных) и за 8 приемов – ручные подкрутки (2 серия, 9 животных). Исследование проводили на этапах: через 28 дней дистракции, 30 дней фиксации и месяц после снятия аппарата.

После альдегидно-осмиевой фиксации образцы хряща дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне, заключали в аралдит, при этом для получения репрезентативных препаратов при резко выраженной вертикальной анизоморфии суставного хряща кусочки ориентировали так, чтобы плоскость среза была перпендикулярна суставной поверхности. Полу-тонкие срезы толщиной 1,0 мкм готовили на ультратоме "Nova" фирмы LKB (Швеция) и окрашивали метиленовым синим или метиленовым синим-основным фуксином [15]. Микропрепара-

РЕЗУЛЬТАТЫ И

К концу дистракции большинство животных 1 серии пользовались удлиненной конечностью, приступая на нее в стойке или при ходьбе. При этом не было отмечено значительных ограничений движений в суставах, в коленном суставе определялась умеренная сгибательная контрактура, амплитуда движений составляла 80-90º (норма 100-110º). Положение стопы было близко к физиологическому.

Суставной хрящ наружного мыщелка бедра макроскопически был гладким, жемчужнобелого цвета, при детальном рассмотрении можно было отметить сухость хрящевой поверхности. При количественном морфологическом исследовании отмечено истончение сус- личественного анализа, которые позволили бы объективно оценить характер изменений и регенерации суставного хряща в данных условиях.

Учитывая эти положения, целью данной работы явилось изучение морфофункциональных характеристик суставного хряща в условиях дозированного растяжения голени с помощью современных методик (световая микроскопия полутонких срезов, компьютерная морфометрия).

И МЕТОДЫ ты исследовали на фотомикроскопе фирмы "Оpton" (Германия) с аппаратно-программным комплексом "ДиаМорф" (Москва). В программах той же фирмы изображения оцифровывали и морфометрировали. Измерения проводили в микрометрах после предварительной геометрической калибровки по оцифрованной с тем же увеличением шкале объект-микрометра. При оценке объемных отношений структур исходили из принципа А. Delesse (1847) VVi = AAi [1, 11]. Определяли высоту (h) хряща и зон в его составе, в поле зрения подсчитывали число следов хондроцитов, площади их и межклеточного вещества, рассчитывали объемную (VVхц) и численную (NAхц) плотности всех хондроцитов, численную плотность пролиферирующих хондроцитов (NAпхц) и величину их пула – выраженное в процентах отношение NAпхц/NAхц [2]. В качестве контроля морфометрировали суставной хрящ интактных животных. Анализ цифрового материала был проведен методами вариационной и непараметрической статистики. Достоверность различий оценивали в программе Microsoft "Excel" 97 по W-критерию Вилкоксона и критерию Стьюдента [6, 16].

ОБСУЖДЕНИЕ тавного хряща в среднем на 26% по сравнению с контролем (табл. 1). Сохранялась зональная структура, за исключением разрушения бесклеточной пластинки (lamina splendens). В части наблюдений межклеточное вещество поверхностной зоны теряло свою гомогенность, выглядело зернистым (рис. 1А), при окраске метиленовым синим наблюдалась слабая метахромазия. Обнаружено статистически достоверное (р<0,05) уменьшение численной плотности хондроцитов по сравнению с контролем (рис. 3). Выявлены пустые лакуны. Объемная плотность хондроцитов в 1,7 раза была ниже, чем в контроле (табл. 1).

Таблица 1

Количественные характеристики хрящевой ткани суставной выстилки бедренной кости при удлинении голени

Параметры	Контроль	Срок эксперимента
		Д 28		Ф 30		БА 30
		1 серия	2 серия	1 серия	2 серия	1 серия	2 серия
Vv (%)	9	5	6,12	8,23	8,34	8,38	6,74
xондроцитов		•••	• ••	–	–	• ••	• ••
Na хц (M ± m)	6,1 ± 0,79	3,8 ± 0,7 •••	6,2 ± 0,4 • ••	5,9 ± 0,5 –	6,2 ± 0,6 –	5,3 ± 0,6 –	5,9 ± 0,4 –
h поверхн. зоны хряща	105 ± 2	63 ± 0,6	77 ± 1,4	90 ± 1,2	100 ± 1,1	100 ± 1,5	106 ± 2,2
(мкм, M ± m)		***	***	***	***	–	–
h хряща	475 ± 1,3	356 ± 1,5	369 ± 2,5	392 ± 2,1	415 ± 2,1	464 ± 6,5	468 ± 0,5
(мкм, M ± m)		***	***	***	***	–	–

Примечание: *** достоверные различия между сериями по критерию Стьюдента (р < 0,001), ••• достоверные различия между сериями по критерию Вилкоксона (р < 0,05), жирным шрифтом выделены достоверные различия с контролем (р < 0,05), для параметров Vv, Na – по критерию Вилкоксона, h хряща и его поверхностной зоны – по критерию Стьюдента; – - различия между сериями недостоверны.

Рис. 1. Поверхностная зона суставного хряща через 28 дней дистракции. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Микрофото. Об.- 40; ок.- 12,5х. А - 1 серия опытов. Б - 2 серия опытов

контроль

1 серия          2 серия

дистракция 28 дней     фиксация 30 дней    без аппарата 30 дней

Рис. 3. Численная плотность хондроцитов в cуставном хряще бедренной кости

В средней зоне отмечено увеличение количества двух-, четырехчленных изогенных групп, что указывало на повышение пролиферативной активности клеток. Величина пула пролиферирующих хондроцитов на 24% выше контроля (рис. 4).

1 серия

2 серия         контроль

дистракция 28 дней

фиксация 30 дней    без аппарата 30 дней

Рис. 2. Объемная плотность (%) хондроцитов в суставном хряще бедренной кости

Рис. 4. Величина (%) пула пролиферирующих хондроцитов в суставном хряще бедренной кости

В базальной зоне была отчетливо выражена базофилия межклеточного вещества вокруг изогенных групп (территориальный матрикс), что косвенно свидетельствовало о повышении функциональной активности хондроцитов. Базофильная линия не нарушена.

Во 2 серии животные также пользовались удлиненной конечностью, приступая на нее в стойке или при ходьбе, но наблюдался слабо выраженный отек параоссальных тканей. В коленном

суставе определялась умеренная сгибательная контрактура. В большей части наблюдений стопа была близка к эквинусному положению.

Макроскопически суставной хрящ был матовый, местами шероховатый. Морфометрически отмечено достоверное (p < 0,01) уменьшение высоты хряща на 23% по сравнению с контролем. Численная плотность хондроцитов поверхностной зоны была незначительно ниже контроля (рис. 3), клетки уплощены. Объемная плотность хондроцитов была в 1,6 раза ниже, чем в контрольной серии (рис. 2). Бесклеточная пластинка была разрушена, межклеточное вещество поверхностной зоны теряло свою гомогенность, начала выявляться его фибриллярная структура (рис. 1Б). Окраска метиленовым синим выявляла слабую метахромазию межклеточного вещества в участках разволокнения. В средней зоне численная плотность клеток достоверно увеличивалась (p < 0,05) на 15% по сравнению с контролем за счет увеличения числа двух- и четырехчленных изогенных групп. Величина пула пролиферирующих хондроцитов была на 39% выше контроля (рис. 4).

Через 30 дней фиксации все собаки 1 и 2 серий практически полностью нагружали оперированную конечность, амплитуда движений в коленном суставе приближалась к норме и составляла 90-100°.

Макроскопически суставной хрящ был матовый, местами истончен, с бледно-фиолетовыми пятнами. При количественном исследовании в 1 серии отмечено достоверное (p < 0,001) уменьшение высоты хряща на 18% по сравнению с контролем (табл. 1). Отсутствовала бесклеточная пластинка, была нарушена гомогенность межклеточного вещества поверхностной зоны, выявлены участки разволокнения; часть хондроцитов отличалась большими размерами и округлой формой (рис. 5А).

В большинстве случаев при окраске метиленовым синим межклеточное вещество поверхностной зоны было ортохроматичным. В средней и базальной зонах была выражена слабая метахромазия территориального матрикса. Численная плотность хондроцитов на 7% меньше, чем в контроле. Обнаружено достоверное (р<0,05) повышение объемной плотности хондроцитов по сравнению со сроком 28 дней дистракции (рис. 2), различия с контролем по этому параметру были недостоверны (р > 0,05). Величина пула пролиферирующих хондроцитов на 21% выше контроля (рис. 4). Базальная зона сохраняла обычное строение.

Во 2 серии хрящ местами имел темнофиолетовую окраску, был истончен, в некоторых случаях отмечали эрозии по боковой поверхности мыщелка. При количественном морфологическом исследовании выявлено уменьшение высоты хряща на 13% по сравнению с контролем (табл. 1). Бесклеточная пластинка была разрушена, на поверхности хряща встречались открытые лакуны хондроцитов, как пустые, так и с обнаженными клетками. Матрикс поверхностной зоны терял гомогенность, выглядел зернистым, отмечено разволокнение (рис. 5Б).

Рис. 5. Поверхностная зона суставного хряща через 30 дней фиксации. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Микрофото. Об. 40; ок. 12,5х. А - 1 серия опытов, стрелкой показан хондроцит округлой формы (ХО). Б - 2 серия опытов

В окрашенных метиленовым синим препаратах обнаруживалась метахромазия неодинаковой интенсивности в топографически различных участках межклеточного вещества. В поверхностной зоне с ее гранулярно-волокнистым матриксом мелкоточечные участки метахромазии выявлялись на поверхности демаскированных пучков коллагеновых волокон. В промежуточной зоне матрикс сохранял гомогенный вид, но небольшие ортохроматически окрашенные участки в нем соседствовали с обширными слабо метахроматичными полями. Глубокая зона отличалась выраженной высокоинтенсивной метахромазией территориального матрикса и присутствием в межтерриториальном матриксе участков с метахроматической реакцией как слабой, так и средней интенсивности.

Параллельно с признаками деструктивных процессов обнаружено увеличение пролиферации хондроцитов в поверхностной зоне. Величина пула пролиферирующих хондроцитов составляла 56% (рис. 4). Численная плотность клеток досто- верно не отличалась от контроля. Базофильная линия отчетливо выражена, не нарушена.

Через месяц после снятия аппарата функция коленного сустава собак обеих серий эксперимента не отличалась от исходных значений, животные в полном объеме пользовались оперированной конечностью. Макроскопически в обеих сериях отмечали блестящие гладкие суставные поверхности жемчужно-белого цвета.

В 1 серии высота хряща была увеличена на 24% по сравнению со сроком 28 дней дистракции и существенно не отличалась от контроля (р > 0,05). Структура не нарушена, бесклеточная пластинка сохранена, межклеточное вещество поверхностной зоны было гомогенным (рис. 6А), ортохроматичным. В средней зоне преобладали двух- и четырехчленные изогенные группы клеток. Величина пула пролиферирующих хондроцитов составляла 57%. Морфометрический анализ показал, что объемная и численная плотность хондроцитов по зонам существенно (р>0,05) не отличалась от контроля (табл. 1). Базофильная линия была отчетливо выражена, непрерывна.

Во 2 серии высота хряща была близка к высоте хряща интактных животных (табл. 1). Структура не нарушена, присутствовала бесклеточная пластинка (рис. 6Б), лишь в одном случае сохранялось разволокнение верхней 1/3 поверхностной зоны. Морфометрически обнаружено статистически достоверное (р<0,05) уменьшение объемной плотности клеток во всех зонах хряща по сравнению с контролем (рис. 2). Численная плотность клеток существенно не отличалась от контрольной серии (р > 0,05). Величина пула пролиферирующих хондроцитов составляла 60% (рис. 4).

Рис. 6. Суставной хрящ через месяц после снятия аппарата, полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Микрофото. Об. 6,3; ок. 12,5х. А - 1 серия опытов, Б - 2 серия опытов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что в период удлинения голени в суставном хряще собак обеих серий происходили аналогичные изменения: в конце дистракции отмечено уменьшение высоты хряща, дезорганизация межклеточного вещества поверхностной зоны, разрушение бесклеточной пластинки, уменьшение объемной и численной плотности хондроцитов, которое сопровождалось повышением пролиферативной активности оставшихся клеток.

В период фиксации в обеих сериях также сохранялось сниженное значение высоты хряща, отмечены очаги разволокнения, наблюдалось увеличение численной, объемной плотности клеток по сравнению с предыдущим сроком эксперимента. По сравнению с контролем значения этих параметров оставались сниженными, увеличивался пул пролиферирующих хондроцитов, что свидетельствовало о повышении функ- циональной и пролиферативной активности хондроцитов.

На протяжении всего эксперимента в обеих сериях отмечали метахромазию в участках разволокнения поверхностной зоны, что косвенно свидетельствовало о дезорганизации межклеточного вещества и увеличении концентрации освободившихся кислых групп гликозаминогликанов, дающих реакцию метахромазии [14].

Возможность анализировать интенсивность метахромазии позволяет в топографически различных участках хряща определять природу химических сдвигов, так как известна [13] зависимость устойчивости и степени выраженности реакции от плотности расположения свободных анионных групп в молекулах субстрата.

Интенсивность деструктивно-репаративных процессов была выше при ручной подкрутке, что, вероятно, связано с большей, чем при автодистракции, величиной одномоментного удли- нения и более выраженным снижением двигательной активности, результатом которого является изменение величины и периодичности циклических нагрузок на суставной хрящ и неизбежное нарушение диффузионно-нагрузочного механизма снабжения его трофическими и пластическими веществами [8]. По результатам биохимических исследований, степень деструктивных изменений гиалинового хряща определяется темпом и дробностью тракции.

У животных 2 серии на протяжении всего эксперимента уменьшение высоты хряща происходило в меньшей степени, чем в 1 серии, что, вероятно, обусловлено более выраженной дезорганизацией межклеточного вещества поверхностной зоны, накоплением и перераспределе- нием гидрофильных гликозаминогликанов, в результате чего возникает набухание основного вещества и коллагеновых волокон [14].

Через месяц после снятия аппарата высота хряща в обеих сериях была близка к высоте хряща интактных животных. Возврат к двигательному стереотипу способствовал восстановлению структуры суставного хряща.

Таким образом, проведенные патоморфоло-гические исследования и анализ количественных данных позволили выявить общие закономерности изменений морфофункционального состояния суставного хряща при удлинении голени в обеих сериях и показали, что применение автодистракции для суставного хряща было более щадящим.