Морфофункциональная оценка FAP+ и -SMA+-клеток в различные сроки токсического фиброза печени у крыс

Lebedeva EI. The morphological and functional assessment of FAP+ and α-SMA+-cells in different times of rat toxic liver fibrosis. Morfologicheskie Vedomosti – Morphological newsletter. 2023;31(3):794. (3).794

Введение. При хронических заболеваниях печени разрастание фиброзной соединительной ткани связано с их этиологией, стадией фиброза и обусловлено гетерогенностью популяцией миофибробластов, вовлеченных в процесс, жиронакапливающих клеток, портальных фибробластов, циркулирующих фиброцитов, гемопоэтических и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга [1-4]. Жиронакапливающие клетки (далее - ЖК) считают основной клеточной популяцией, синтезирующей межклеточное вещество [4]. В литературе они имеют разные названия: клетки Ито, липоциты печени, перисинусоидные клетки, перициты и звездчатые клетки. Эмбриональное происхождение ЖК не установлено, но известно, что они экспрессируют белки энтодермы и мезодермы. В здоровой печени ЖК располагаются в перисинусоидном пространстве, контактируя с гепатоцитами, звездчатыми макрофагами и эндотелиоцитами, проявляя не активированный фенотип [5]. В норме ЖК неправильной формы, с округлым ядром, накапливают витамин А и жиры, синтезируют цитокины, матриксные металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы; они практически не экспрессируют гладкомышечный альфа-актин (a-SMA). ЖК регулируют кровоток в синусоидах, функционируя как перициты, обладают низкой пролиферативной активностью и способностью к секреции коллагенов [4-5]. Токсические и вирусные поражения печени стимулируют активацию и трансдифференцировку ЖК в миофибробластический фенотип [6-7]. Этот процесс сопровождается гиперплазией и гипертрофией шероховатой эндоплазматической сети, исчезновением в цитоплазме липидных капель, изменением организации цитоскелета, избыточной экспрессией a-SMA, коллагенов и цитокинов. Механизмы активации ЖК, особенно в фазу ее инициации, весьма сложны и не до конца изучены. Предполагается, что пул покоящихся и активированных ЖК пополняется также за счет клеток костного мозга [4,8].

Портальные фибробласты (далее -ПФ) или перидуктулярные мезенхимальные клетки, являются второй популяцией клеток, вырабатывающих межклеточное вещество при фиброзе печени [1]. Сведений о функциях ПФ в норме недостаточно. Расположены они в соединительной ткани портальных зон, преимущественно вокруг междольковых желчных протоков. Происхождение и роль ПФ в развитии холестатического фиброза до сих пор остаются дискуссионными. Окончательно не установлено, являются ли ПФ основной популяцией миофибробластов и на каких этапах фиброгенеза их вклад наиболее значителен, синтезируют ли ПФ фибриллярные коллагены, типичные для фиброза или они выполняют другие роли в фиброге-незе [9-10]. Одни авторы предполагают, что активированные ПФ принимают участие в секреции межклеточного вещества только при хронических холестатических заболеваниях печени [1]. В экспериментальных работах с использованием репортерных Col-GFP и Mdr2-/- мышей на начальных стадиях холестатического фиброгенеза источником миофибробластов выступали активированные ПФ. При этом дальнейшее прогрессирование фиброза приводило к трансдифференцировке ЖК в фиброгенный фенотип [10]. Научные работы последних лет указывают, что при холестатическом фиброзе одновременно идентифицировались две разные популяции миофибробластов, происходящие из ПФ и ЖК [9-10]. Вероятно, эти противоречивые данные являются результатом различий используемых экспериментальных моделей, методов исследований и как следствие отличий в интерпретации полученных результатов. Изучение фиброгенной популяции клеток применительно к этиологии и стадии фиброза печени может имеет существенное значение в разработке антифибротических препаратов [11] .

Цель исследования: морфофункциональная оценка активированных портальных фибробластов (FAP + ) и жиронакапливающих клеток (a-SMA + ) печени в различные сроки токсического фиброза печени крыс.

Материалы и методы исследования. В настоящей публикации использованы международные термины по цитологии и гистологии [12]. В экспериментах использовались крысы-самцы породы Ви-стар массой 190-210 г. Протокол исследования одобрен комиссией по биоэтике и гуманному обращению с лабораторными животными Витебского государственного медицинского университета (протокол № 6 от 03.01.2019 г.). Животных содержали в пластико-металлических клетках по 6 особей при естественном освещении и со свободным доступом к корму и воде. Температура в помещении вивария поддерживалась на уровне 21-23°С, влажность воздуха составляла около 50%. Фиброз и цирроз печени моделировали путем хронической интоксикации тиоацетамидом (далее - ТАА), (Acros Organics). Свежеприготовленный раствор ТАА вводили интрага-стрально через зонд в дозе 200 мг/кг массы тела 2 раза в неделю в течение 17 недель. Крысы контрольной группы (n=12) получали воду без ТАА в аналогичном объеме. Животных рандомизировали на 8 групп по 12 животных в каждой в зависимости от длительности воздействия ТАА: 3 недели (1-я группа), 5 недель (2-я группа), 7 недель (3-я группа), 9 недель (4-я группа), 11 недель (5-я группа), 13 недель (6-я группа), 15 недель (7-я группа), 17 недель (8-я группа).

После декапитации под кратковременным эфирным наркозом из большой левой доли печени крыс забирали образцы печени диаметром 5-10 мм, которые помещали в 10% раствор нейтрального формалина на фосфатном буфере и фиксировали в течение 24 ч. Затем проводили обработку фиксированного материала с последующей заливкой в парафин с использованием автомата для гистологической обработки ткани STP-120 (Thermo Fisher Scientific) и станции для заливки ткани парафином EC350 (Thermo Fisher Scientific). От каждого животного получали по одному блоку для каждого метода окрашивания и с помощью ротационного микротома НМ340Е (MICROM, Laborgerate GmbH) готовили по 3-4 среза толщиной 4 мкм и помещали их на предметные стекла. Для получения обзорных гистологических препаратов срезы печени окрашивали гематоксилином и эозином, а для выявления соединительной ткани – по Маллори с помощью автомата для окраски HMS70 (Thermo Fisher Scientific). Степень фиброза определяли с помощью полуколичествен-ной шкалы K.G. Ishak [13].

Иммуногистохимическое исследование проводили на парафиновых срезах [14]. В качестве маркера активированных портальных фибробластов применяли по- ликлональные кроличьи антитела FAP (FAP-alpha, пролилэндопептидаза FAP, в разведении 1:100), активированных ЖК – моноклональные мышиные антитела к α-SMA (alpha-SMA, АСТА2, в разведении 1:1000). Использовались антитела производства Wuman Elabscience Biotechnology Incorporated Company, набор 2-step plus Poly-HRP Anti Rabbit/Mouse IgG Detection System/with DAB Solution; Retrieve-All Antigen (Unmasking System Basic), буфер для разведения антител (BioLegend), Твин-20 (Glentham Life Sciences), PBS (Melford). Для лучшей ориентации в препарате и правильной идентификации клеток, содержащих искомый антиген, срезы докрашивали гематоксилином Майера в течение 1 мин. Для объективной интерпретации результатов для каждой исследуемой серии (группы животных) включали положительный и отрицательный контроли. Иммуногистохимическую окраску оценивали, как положительную, только при отсутствии окрашивания в отрицательном контроле и, наоборот, как отрицательную при окрашивании в положительном контроле.

Гистологические препараты микро-скопировали с применением компьютерных программ анализа изображений ImageScope Color и cellSens Standard. Количество FAP-позитивных клеток (FAP+-клетки) и α-SMA-позитивных клеток (α-SMA+-клетки) подсчитывали в трех полях зрения каждого гистологического среза на базе микроскопа Olympus BX51 при увеличении объектива 40×.

Полученные результаты обрабатывались статистически. Для каждой выборки определяли нормальность частотного распределения каждого признака. Выборки не являлись малыми (n=60>50), поэтому проверку осуществляли по критерию Лиллие-форса. Получали описательные статистики и описывали количественные экспериментальные данные в виде средних и их соответствующих доверительных интервалов (М (95% ДИ: j-q)), медианы и значения 15-го – 85-го процентилей (Ме (15%;85%)). Об уровне статистической значимости различий судили по t-критерию Стьюдента; в случае отличия выборок от нормального частотного распределения использовали U-критерий Манна-Уитни.

Рис. 1. Микрофото гистологических препаратов печени крыс. Окр.: иммуногистохимическое окрашивание на FAP + (А, В, Д), на a-SMA⁺ (Б, Г, Е), докраска гематоксилином Майера. Ув.: х400. Обозначения: А - печень крысы контрольной группы; Б - печень крысы контрольной группы; В - печень крысы с индуцированным циррозом через 9 недель после начала эксперимента; Г - печень крысы с индуцированным циррозом через 9 недель после начала эксперимента; Д - печень крысы с индуцированным циррозом через 15 недель после начала эксперимента; Е - печень крысы с индуцированным циррозом через 15

недель после начала эксперимента

Результаты исследования и обсуждение. Углубленное изучение источника миофибробластов и понимание молекулярных механизмом, регулирующих изменение фенотипа клеток печени в фиброгенную линию, имеют фундаментальное значения для разработки анти-фибротических препаратов [1-4, 11, 15]. При фиброзе органов миофибробласты преимущественно идентифицируют с помощью маркеров a-SMA (активированные ЖК) и FAP (активированные ПФ) [16-18]. В большинстве органов в условиях нормы уровни мРНК и белка FAP были низкими, за исключением молочной железы, эндометрия матки, поджелудочной железы, плаценты и кожи. В здоровой печени ЖК практически не экспрессируют маркер a-SMA [2, 4-5, 15]. Полученные в рамках настоящего исследования результаты согласуются с литературными данными. В печени контрольных крыс FAP+-клетки не определяли (рис. 1-А). В синусоидах отсутствовали a-SMA+-клетки (рис. 1-Б), однако в отдельных случаях их выявляли в стенках междольковых артерий, междольковых и поддольковых вен.

При наступлении портального фиброза печени (F1, 3 недели интоксикации) в портальных зонах наблюдали FAP+-клетки, а в синусоидах – α-SMA+-клетки. Обе популяции клеток имели округлую форму. Спустя 5 недель с появлением портального, мостовидного, местами центролобулярного и диффузного перицел- люлярного фиброза (F2/F3) количество FAP+-клеток достоверно увеличилось (р=0,0213), а α-SMA+-клеток – не изменилось (р=0,3075) по сравнению с 3 неделей. На всех последующих стадиях эксперимента установлены достоверные различия как для FAP+-клеток (р=0,00001), так и для α-SMA+-клеток (р=0,00001) по сравнению с 3 неделей эксперимента. В таблице 1 представлена динамика числа FAP+- и α-SMA+-клеток на всех этапах эксперимента.

Таблица 1

Относительная величина площади соединительной ткани и количества FAP+- и a-SMA+- клеток в различные сроки фиброза и цирроза печени крыс при интоксикации тиоацетамидом

Недели эксперимента/ стадии фиброза	Площадь соединительной ткани в %, Ме (15%,'85%)	Количество клеток, М (95% ДИ: j-q)
		FAP +	a-SMA+
контроль	1,50 (1,000;3,000)	-	-
3 недели/F1	3,00 (2,000;5,000)	5,416 (4,814;6,018)	7,722 (6,426;9,01)
5 недель/F2/F3	4,00 (2,000;6,500)	9,194 (8,080;10,308)	11,777 (10,480;13,074)
7 недель/F3/F4	5,00 (2,000;8,000)	11,972 (10,361;13,582)	18,888 (17,283;20,493)
9 недель/F4/F5	7,00 (4,000;10,000)	14,694 (13,083;16,305)	20,861 (18,958;22,763)
11 недель/F5	9,00 (6,000;11,000)	17,222 (15,979;18,465)	25,250 (23,064;27,435)
13 недель/F6	11,00 (7,500;14,500)	21,944 (20,251;23,637)	31,500 (28,381;34,618)
15 недель/F6	16,00 (9,000;21,500)	24,888 (22,483;27,294)	52,722 (48,076;57,377)
17 недель/F6	21,00 (13,000;29,000)	29,222 (27,143;31,301)	58,944 (54,318;63,570)

Следует отметить, что по мере прогрессирования фиброза печени скорость разрастания соединительной ткани была не одинаковой (табл. 1). К 3-й неделе эксперимента отмечали умеренное формирование соединительной ткани в портальных зонах (рис. 2-А, рис. 2-Б). Однако, на 5-й неделе образование фиброзной соединительной ткани замедлялось, при этом ее одновременно определяли, как в портальных зонах, так и в паренхиме. К 7й неделе эксперимента интенсивность синтеза соединительной ткани сохранилась практически на прежнем уровне по сравнению с 5-й неделей (рис. 2-В). На этапе перестройки паренхимы печени и перехода от фиброза к циррозу вновь наблюдалось усиленное формирование соединительной ткани аналогичное началу эксперимента (3 неделя). На 9-й неделе происходило образование ложных печеночных долек у портальных зон (рис. 2-Г), что являлось морфологическим критерием начальной трансформации фиброза в цирроз. В период с 11-й по 17-ю неделю разрастание соединительной ткани достигало максимально значения (рис. 2-Д, рис. 2-Е). При попарном сравнении на разных стадиях эксперимента применительно к площади соединительной ткани, количеству FAP+ и α-SMA+-клеток получены отличительные результаты (табл. 2).

При анализе таблицы 2 следует, что до наступления стадии фиброза печени F3/F4 (3-й по 7-ю неделю) количество FAP+ и α-SMA+-клеток увеличивалось попеременно. На этапах трансформации фиброза в цирроз (с 7-й по 11-ю неделю) повышение их количества происходило незначительно. На стадии неполного (F5) и до наступления достоверного цирроза (F6, с 11-й по 15-ю неделю) количество FAP+ и α-SMA+-клеток было непостоянным: происходило попеременное увеличе-

Рис. 2. Микрофото гистологических препаратов печени крыс. Окр.: по Маллори. Ув.: х200. Обозначения: А – печень крысы контрольной группы, стрелками отмечена соединительная ткань; Б – печень крысы с индуцированным циррозом через 3 недели после начала эксперимента, стрелками отмечена соединительная ткань; В – печень крысы с индуцированным циррозом через 7 недель после начала эксперимента, стрелками отмечена соединительная ткань; Г – печень крысы с индуцированным циррозом через 9 недель после начала эксперимента; Д – печень крысы с индуцированным циррозом через 13 недель; Е -печень крысы с индуцированным циррозом через 17 недель после начала эксперимента

ние и уменьшение их количества. В настоящее время объяснить такие количественные вариации не представляется возможным. Предположительно, это связано с компенсаторно-приспособительными механизмами, происходящими в печени, индуцированием/ингибировани-ем молекулярных сигналов, регулирующих пролиферацию этих клеток или другими процессами. С помощью иммуногистохимических методов было установлено, что две морфологически неоднород-

Таблица 2

Показатели значимости попарных различий площади соединительной ткани и числа FAP+ и α-SMA+-клеток

Недели эксперимента Уровень значимости Площадь соединительной ткани FAP+-клетки α-SMA+-клетки 3-5 р=0,9560 р=0,0000 р=0,3075 5-7 р=0,9936 р=0,2497 р=0,0000 7-9 р=0,1981 р=0,2757 р=0,9604 9-11 р=0,7912 р=0,3775 р=0,2073 11-13 р=0,0000 р=0,0000 р=0,7229 13-15 р=0,0000 р=0,6449 р=0,0000 15-17 р=0,0000 р=0,1406 р=0,2045 ные популяции миофибробластов, экспрессирующих различные типы маркеров, имели отличительную локализацию на ранних сроках исследований. а-БМА+-клетки округлой формы до начала процесса трансформации фиброза печени в цирроз (F4/F5, 9 недель) определяли в синусоидах печени и очагах некроза (рис. 1Г). На поздних сроках эксперимента (с 11й по 17-ю недели) а-БМА+-клетки находились как в синусоидах, так и в соединительнотканных септах (рис. 1-Е). Полученные результаты согласуются с данными других исследователей [16-19]. До наступления верифицированного цирроза (13-я неделя) количество а-БМА+-клеток и площадь соединительной ткани нарастали линейно, а затем происходило резкое скачкообразное повышение этих показателей (табл. 1).

FAP+-клетки округой формы через 3 недели эксперимента располагались вокруг междольковых сосудов и вблизи междольковых желчных протоков портальных зон, а со стадии F2/F3 их выявляли в соединительнотканных септах и синусоидах (рис. 1-В, рис. 10-Д). На данном этапе рядом с желчными протоками концентрировались крупные СК19+-клетки. По морфологическим признакам они соответствуют печеночным стволовым/овальным клеткам. С 5-й недели эксперимента отмечали увеличение числа междольковых желчных протоков и к его концу вокруг одной портальной зоны можно было обнаружить более 30 их поперечных сечений (протоковая реакция) [20]. Установлено, что эпителиальные клетки протоковой реакции экспрессируют профиброгенные факторы (TGF-в, PDGF) и могут активировать ПФ [21]. На гистологических препаратах отмечалось направленное разрастание волокон соединительной ткани с FAP+-клетками от двух портальных зон через паренхиму печени навстречу друг другу, таким образом, предопределяя путь для фиброзной соединительной ткани и формирования соединительнотканных мостов - мостовидный фиброз. Важно отметить, что образование ложных печеночных долек происходило у портальных зон. Предположительно, FAP+-клетки первыми синтезируют межклеточное вещество в пор- тальных зонах и, возможно, регулируют его секрецию, участвуют в формировании соединительнотканных септ (мостов). а-БМА+-клетки выступают в роли миофибробластов позже. Вероятно, этап активации и трансдифференцировки ЖК более продолжительный или молекулярные сигналы, регулирующие смену фенотипа клеток, индуцируются с опозданием, или до определенного момента ингибируются. Не следует исключать тот факт, что на ранних стадиях фиброгенеза ЖК выполняют другие функции. На 5-й неделе количество а-БМА+-клеток не изменилось (р=0,3075) по сравнению с 3-й неделей эксперимента. При этом отмечалось повышение числа FAP+-клеток (табл. 1 и 2). Для объективной интерпретации того, какая из клеточных популяций доминирует в синтезе межклеточного вещества на ранних этапах фиброза требуются более детальные исследования.

FAP - это многофункциональный белок. Он принимает участие в регуляции энергетического и липидного обменов, стимулирует воспаление и выполняет профиброгенную функцию. Роль белка FAP в фиброзе печени остается до конца не изученной и его фармакологическое ингибирование в качестве варианта потенциальной терапии фиброза печени до сих пор не проводилось [2, 11, 22-24]. В печени крыс при тиоацетамид-индуцированном фиброзе и циррозе жировая дистрофия не диагностировалась. Лимфоидно-гистиоцитарный инфильтрат до 9-й недели был выражен незначительно, а к концу эксперимента определялись очаги с лимфоидно-гистиоцитарным инфильтратом в соединительной ткани портальных зон и соединительнотканных септ. На основании этого можно заключить, что функции белка FAP обусловлены состоянием плотности соединительной ткани, клеточным составом, активностью генов и эпигенетическими механизмами.

Заключение. Таким образом, при экспериментальном токсическом фиброзе и циррозе в печени крыс иммуногистохимическим методом одновременно были выявлены две морфологически неоднородные популяции миофибробластов, которые экспрессировали различные типы маркеров. а-БМЛ+-клетки на ранних стадиях фиброза не располагались совместно с FAP+-клетками. До начала процесса трансформации фиброза печени в цирроз (F4/F5) а-БМЛ+-клетки отмечали в синусоидах печени и очагах некроза, а затем они локализовались как в синусоидах, так и в соединительнотканных септах, вокруг ложных печеночных долек. FAP+-клетки на стадии портального фиброза располагались около междольковых сосудов и междольковых желчных протоков портальных зон, а со стадии F2/F3 их выявляли в соединительнотканных септах и синусоидах. В количественном отношении на всех стадиях фиброза преобладали а-БМЛ+-клетки.

На основании полученных результатов можно предположить, что FAP+-клетки играют главную роль в развитии портального и начального этапа мостовидного фиброза. Их следует рассматривать как одну из разновидностей популяции миофибробластов при тиоацетамид-индуцированном фиброгенезе печени. РЛГ+-клетки могут быть использованы в качестве мишени для антифибротической терапии.