Морфофункциональная оценка кардиопротекторного действия производных ГАМК в условиях хронической алкогольной интоксикации

Хроническая алкогольная интоксикация обычно сопровождается значительными нарушениями функций соматических органов, в том числе и сердца. По статистике, до 15 % больных, особенно в молодом возрасте, умирают внезапно от сердечной недостаточности, возникающей в результате появления, под воздействием этилового спирта, органических изменений в сердце, что проявляется падением сократительной функции миокарда [8, 9, 15]. Поэтому актуальной задачей современной кардиофармакологии является поиск лекарственных препаратов, ограничивающих токсическое действие этанола на сердце и устраняющих последствия кардиотоксичности алкоголя.

В связи с многофакторным характером алкогольного поражения миокарда, для фармакокоррекции его необходимо использовать препараты, включающие в себя кардиопротекторные свойства различных групп: антиагрегантов, антигипок-сантов, антиоксидантов и др. К числу таких препаратов можно отнести ГАМК-ергические средства [3-7, 13].

ЦЕЁЬ РАБОТЫ

Морфофункциональная оценка кардиопро-текторного действия нового структурного аналога ГАМК - соединения РГПУ-147 в условиях хронической алкогольной интоксикации.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 48 белых беспородных крысах-самцах массой 260-280 г. Животные были поделены на 4 группы по 12 особей в каждой. 1-я группа - позитивного контроля (интактные животные), 2-я группа - алкоголизиро-ванные животные (негативный контроль), получавшие за 40 мин до введения этанола физиологического раствора внутрибрюшинно в эквивалентных исследуемым препаратам объемах, 3 и 4 группы - опытные, которые за 40 мин до введения этанола получали соединение РГПУ-147 и препарат сравнения пирацетам в дозах 50 и 200 мг/кг соответственно, 1 раз в день внутрибрюшинно. Хроническую алкогольную интоксикацию моделировали путем интрагастрального введения 50 %-го р-ра этанола 8 г/кг 1 раз в день в течение 30 дней. Содержание животных производилось в соответствии с "Приказом М3 РФ № 750", Рекомендациями Комитета при Минздраве России, рекомендациями ВО3 по экспериментальной работе с использованием животных [2, 14, 16] на базе НИИ фармакологии и кафедры фармакологии и биофармации ФУВ ВолГМУ.

Через месяц после алкоголизации по 6 животных из каждой группы под нембуталовым наркозом декапитировали. Исследуемый материал (ткани сердца целиком) фиксировали в 10 %-м р-ре формалина в течение 48 часов с дальнейшим обезвоживанием и изготовлением парафиновых блоков. Для морфологического исследования миокарда использовались серийные фронтальные срезы, окрашенные гематоксилином и эозином, Суданом III и IV. Было произведено 100 срезов на каждое сердце экспериментального животного. Микрофотосъемку с микропрепаратов производили фотокамерой CONTEX на увеличении 100, 400.

Морфометрическое исследование проведено в соответствии со сложившимися принципами системного количественного анализа [1]. Для прямого морфометрического исследования были использованы оцифрованные микрофотограммы миокарда крыс, обработанные с помощью программы для морфометрии "Image Tool, 3,00" (Texas, USA). В ткани миокарда определяли объемные доли (%) кардиомиоцитов (КМЦ), сосудов и соединительной ткани. Также определяли среднюю толщину (мкм), среднюю площадь поперечного сечения КМЦ (мкм2) и их ядер (мкм2). Статистическая обработка полученных данных была проведена общепринятыми для медико-биологических исследований методами с использованием пакета анализа "MS Excel" (USA).

Исследование сократимости миокарда и его инотропных резервов осуществлялось с помощью нагрузочных проб: нагрузки объемом, максимальной изометрической нагрузки. Нагрузка объемом осуществлялась путем введения 3 мл/кг физиологического раствора, максимальная изометрическая нагрузка - пережатием восходящей части дуги аорты на 30 с [12]. При этом регистрировались левожелудочковое давление (ЁЖД) и его первая производная (dp/dt+ и dp/dt-). Полученные данные сопоставлялись между собой. Более высокие показатели сократимости миокарда и инотропные резервы у животных опытных групп по сравнению с контрольной группой алкоголизиро-ванных животных свидетельствовали о кардио-протективном действии исследуемых веществ.

Статистическая обработка полученных данных осуществлялась с помощью программы STATISTICA с использованием критерия Ньюмена-Кейлса и представлена в виде М ± S , где М -средняя арифметическая, S - стандартная ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При морфологическом исследовании препаратов у интактной группы животных не было выявлено патологических изменений в миокарде. Общая картина миокарда животных контрольной группы представлена на рис. 1.

Рис. 1. Интактный миокард. Ув. х400

1-2008

У животных, подвергшихся хронической алкоголизации, обнаружены выраженные дегенеративные изменения цитоплазмы и ядер кардиомиоцитов (извитость и жировая инфильтрация кардиомиоцитов, дефрагментация миофибрилл, увеличение и снижение плотности прокрашивания ядер), фиброзные изменения в интерстиции миокарда, нарушение коронарного кровообращения в виде полнокровия сосудов, стазов и сладжирования эритроцитов, петехиальных кровоизлияний, набухания эндотелиоцитов сосудистого русла (рис. 2-5).

При введении соединения РЕПУ-147 алко-голизированным животным изменения в тканях сердца проявлялись в значительно меньшей мере в сравнении с группой алкоголизированных крыс, о чем свидетельствует незначительная извитость кардиомиоцитов, пылевидная жировая инфильтрация, фиксируется небольшое снижение гликогена в цитоплазме кардиомиоцитов; дегенеративные изменения кардиомиоцитов минимальны, с единичными, слабо выраженными, дефрагментированными миофибрилловыми волокнами, отмечается минимальный отёк стромы миокарда с фокусами отложения соединительнотканных волокон. Сосуды менее полнокровны, в них определяются единичные проявления стаза и сладжирования эритроцитов, перива-скулярно фиксируется небольшое количество петехиальных кровоизлияний, отдельные кардиомиоциты незначительно гипертрофированны (рис. 4-5).

Морфологические изменения в миокарде алкоголизированных животных, получавших пирацетам, были более выражены по сравнению с группой животных, которым вводилось соединение РЕПУ-147. В их миокарде отмечается значительная извитость и жировая инфильтрация кардиомиоцитов (особенно ярко проявляющаяся в поперечно расположенных мышечных волокнах), определяются умеренно выраженные жировые вакуоли, фиксируется существенное снижение гликогена в цитоплазме кардиомиоцитов. Обнаружены дегенеративные изменения кардиомиоцитов, сосуды полнокровны, спазмированы, эн-дотелиоциты кровеносных капилляров набухшие, с незначительно выраженной белкововакуольной инфильтрацией, в сосудах определяются явления стаза и сладжирования эритроцитов, периваскулярно фиксируется умеренное количество очагов петехиальных кровоизлияний и незначительно гипертрофированных кардиомиоцитов (рис. 6-7).

В результате проведенных морфометрических исследований обнаружено, что у крыс, подвергшихся 30-дневной алкогольной интоксикации, происходит уменьшение объемной доли кардиомиоцитов, что свидетельствует о снижении числа активно функционирующих клеток (см. табл.).

Рис. 2. Миокард алкоголизированных животных. Ув. *100: 1 - отек стромы, 2 - фиброз интерстиция, 3 - полнокровие со судов, стаз и сладж эритроцитов, 4 - выраженная извитость кардиомиоцитов

Рис. 3. Миокард алкоголизированных животных. Ув. *400: 1 - фрагментация клеток, 2 - извитость кардиомиоцитов, 3 -гиперхромность ядер, 4 - экстравазация эритроцитов, 5 -стромальный отек, 6 - фиброз интерстиция

Рис. 4. Миокард алкоголизированных животных, получавших соединение РГПУ-147. Ув. *400:

1 - умеренное полнокровие сосудов, незначительные явления стаза и сладжа, 2 - незначительный отек ткани, 3 - слабая извитость кардиомиоцитов

Рис. 5. Миокард алкоголизированных животных, получавших соединение РГПУ-147. Ув. *400:

1 - небольшая волнистость миофибрилл, 2 - незначительный межклеточный отек

Рис. 6. Миокард алкоголизированных животных, получавших пирацетам. Ув. *400:

1 - отек межклеточного пространства, 2 - фрагментация и дезинтеграция кардиомиоцитов

Рис. 7. Миокард алкоголизированных животных, получавших пирацетам. Ув. *400:

1 - выраженный отек стромы, 2 - отчетливая извитость мышечных волокон, 3 - выраженные жировые вакуоли, 4 - петехиальные периваскулярные кровоизлияния, 5 - фрагментация кардиомиоцитов, 6 - выраженная гипертрофия клеток, 7 - гипер-хромия ядер кардиомиоцитов

Таблица

Показатели морфометрии миокарда у крыс с хронической алкогольной интоксикацией ( M±m )

Исследуемые показатели	Интактные животные (физиол. р-р)	Алкоголизированные животные (алкоголь)	Пирацетам ± алкоголь	РГПУ-147 ± алкоголь
Объемная доля КМЦ, %	74,8+3,6	66,0±2,4*	68,6±1,7	75,8±2,6**
Объемная доля сосудов, %	2,2+0,2	5,5±0,2*	4,8±0,3**	2,8±0,2**
Объемная доля фибробластов, %	5,2+0,4	7,0±0,4*	6,2±0,4	5,8±0,4**
Объемные доли соединительной ткани и инфильтратов, %	14,6±1,3	25,7±1,8*	22,4±2,1	16,2+1,4**
Толщина КМЦ, мкм	40,0+1,6	58,9±1,8*	50,4±2,3**	46,5±2,8**
Площадь поперечного сечения КМЦ, мкм2	152,5±10,1	290,5±6,9*	211,5±6,9**	161,8+7,9**
Площадь поперечного сечения ядер КМЦ, мкм2	26,8±1,8	27,4±1,6	27,9±0,9	24,0+1,3**

* - достоверные различия негативного контроля с интактной группой (р< 0,05); ** - достоверные различия опытных групп с негативным контролем ( р <0,05).

При этом происходит увеличение объемных долей фибробластов и соединительной ткани, указывающих на явления мелкоочагового фиброза, характерного для гипоксического повреждения ткани миокарда при алкогольной интоксикации и нарастании склеротических процессов. Увеличение объемной доли сосудов можно трактовать как необходимость компенсаторного ангиогенеза в условиях относительной гипоксии. Анализ данных показывает, что, несмотря на уменьшение объемной доли кардиомиоцитов, в последних наблюдается статистически достоверное увеличение таких показателей, как толщина и площадь поперечного сечения (табл.).

Это можно охарактеризовать как явление компенсаторной гипертрофии миокарда. К этому же процессу можно отнести и увеличенный показатель площади поперечного сечения ядер клеток миокарда при алкогольной интоксикации, указывающий на активные синтетические и метаболические процессы в них как отражение внутриклеточной регенерации в ответ на повреждающее действие этилового алкоголя. Однако данный критерий статистически недостоверен (см. табл.).

При морфометрическом исследовании миокарда алкоголизированных животных, получавших соединение РГПУ-147, было обнаружено статистически достоверное, по основной массе критериев, его кардиопротективное действие. Защитное действие препарата сравнения пирацетама выражено незначительно и по ряду морфометрических критериев статистически недостоверно в сравнении с аналогичными показателями алкоголизированных животных контрольной группы.

Хроническая алкогольная интоксикация способствует значительному снижению инотропных резервов сердца, что проявляется в несущественном увеличении у алкоголизированных животных ЁЖД, скорости сокращения (dp/dt±), скорости расслабления (dp/dt-) миокарда в условиях нагрузки объемом и максимальной изометрической нагрузки по сравнению с интактной группой (рис. 1, 2, а-с).

У животных, получавших перед алкоголизацией соединение РГПУ-147 и препарат сравнения пирацетам при нагрузке объемом ЁЖД увеличивалась на 16,5 и 14 %, скорость сокращения -на 24,7 и 16,7 %, скорость расслабления на 27 и 24,4 % соответственно, что было достоверно выше, чем у животных негативного контроля (р <0,05) (рис. 1, а-с ). При максимальной изометрической нагрузке у групп животных, получавших соединение РГПУ-147, статистически значимо ( р <0,05) увеличивались ЁЖД, dp/dt+ и dp/dt- по сравнению с контрольной группой животных, получавших этанол на 60,7; 35,2 и 129 % соответственно. У животных, получавших пирацетам - на 58,4; 29 и 124,5 %, что также было выше, чем в контрольной группе алкоголизированных животных, однако статистически значимых отличий выявлено не было (рис. 2, а-с ).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, морфофункциональное исследование токсического действия алкоголя на сердце показало, что 30-дневное введение 50 %-го р-ра этанола 8 г/кг интрагастрально один раз в день приводит к патологическим изменениям в миокарде крыс. Обнаружено, что данные патологические изменения способствуют нарушению сократительных свойств сердца, которые проявляются при использовании нагрузочных тестов. Аналог гамма-аминомасляной кислоты соединение РГПУ-147, в большей степени, и препарат сравнения пирацетам способны предотвращать повреждающее действие этанола, что подтверждается как морфометрическими данными, так и при исследовании функциональных резервов сердца.

Рис. 1. Изменение ЛЖД ( а ), скорости сокращения ( 6 ) и скорости расслабления ( с ) миокарда у алкоголизированных животных в условиях нагрузки объемом:

* - изменения показателей достоверны по отношению к группе алкоголизированных животных по q-критерию Ньюмена-Кейлса при р <0,05

I ев X е X к X X

X

І

X

время интакт алкоголь+физ.р-р пирацетам+алкоголь

РГПУ-147+алкоголь

В

Рис. 2. Изменение ЛЖД ( а ), скорости сокращения ( 6 ) и скорости расслабления ( с ) миокарда у алкоголизированных животных в условиях максимальной изометрической нагрузки:

* - изменения показателей достоверны по отношению к группе алкоголизированных животных по q -критерию Ньюмена-Кейлса при р <0,05; # - изменения показателей достоверны по отношению к группе животных, получавших препарат сравнения пирацетам по q -критерию Ньюмена-Кейлса при р <0,05

Учитывая политропное действие ГАМК и ее аналогов, можно предполагать, что кардиопро-текторный эффект соединения РГПУ-147 и пирацетама в условиях ХАИ обусловлен способностью ограничивать повреждающее действие активных форм кислорода на мембраны кардио-миоцитов и их гибель, улучшать коронароный кровоток и микроциркуляцию, стимулировать процессы энергообразования [15, 16].

Таким образом, можно сделать заключение, что производные ГАМК - соединение РГПУ-147 и пирацетам - предотвращают повреждающее действие этанола, т. е. обладают кардиопротек-торным действием в условиях хронической алкоголизации.