Морфофункциональная реакция Iba-I и MHC-II позитивных клеток селезенки на введение мелатонина

Введение. Мелатонин — нейропептид и нейротрансмиттер участвующий в синхронизации циркадных ритмов, оказывающий онкопротектор-ное [1], геропротекторное [3, 6] и иммуностимули рующее действие [3, 6, 9, 11]. Экстрапинеальный мелатонин играет ключевую роль в координации клеточных функций и межклеточных связей при иммунном ответе [11]. Одни исследователи считают, что мелатонин не оказывает ни прямого, ни опосредованного Т-лимфоцитами влияния на активированные макрофаги [13]. Результаты других исследований показывают, что количество натуральных киллеров и макрофагов в селезенке под влиянием мелатонина возрастает [8]. Существует ряд исследований, свидетельствующих о чувствительности иммунных клеток селезенки к условиям освещения, в которых находится организм [14] и, вероятно, реакция этих клеток на введение мелатонина будет так же зависеть от светового режима.

Белки главного комплекса гистосовместимости второго класса (MHC-II) необходимы для развития Т-клеточного иммунного ответа, а также для обеспечения взаимодействия между Т-лимфоцитами и макрофагами в процессе иммунного ответа [4], и следовательно, являются специфичными маркерами активированных макрофагов. Динамичность экспрессии молекул MHC-II зависит от функционального состояния клетки и изменения под влиянием различных стимулов. Это один из механизмов, контролирующих индукцию и реализацию иммунного ответа [5]. Ионизирующая кальций связывающая адапторная молекула (Iba-1) идентифицирована как кальций-связывающий белок, экспрессирующийся клетками моноцитарно-макрофагального происхождения [2]. Iba-1 принимает участие в реорганизации актинового скелета и образовании мембранных складок макрофагов при индуцированном фагоцитозе [10]. Связь между Iba-1 и MHC-II молекулами проявляется в процессах антигенпрезентации. Антигены захватываются макрофагальными цитоплазматическими отростками, в образовании которых участвует молекулы Iba-1, и после фрагментации связываются с молекулами MHC-II. Снижение экспрессии Iba-1 или MHC-II приводит к ослаблению иммунного ответа [2]. Следовательно, изменение количества Iba-1- и MHC-II-позитивных клеток является показателем силы иммунного ответа.

Цель исследования - выявить реакции Iba-1- и MHC-II-позитивных клеток селезенки на экзогенный мелатонин при разных световых режимах.

Материал и методы исследования. Объектом исследования служила селезенка 120 двухмесячных мышей-самцов одной массы (18 - 22 г), содержавшихся при сбалансированном рационе питания и в различных условиях освещения.

Животные были разделены на 4 группы:

I - (n = 30) – животные, которые содержались в обычных условиях вивария в течение 4 недель эксперимента (естественное освещение; продолжительность светового дня 8 – 9 часов; освещенность на уровне клеток в утренние часы 50 – 150 люкс, днем в пасмурный день – до 500 люкс, в ясный день – до 1000 люкс, вечером 100 – 200 люкс; влажность воздуха 40 – 60%, свободный доступ к питьевой воде и корму);

• II    - (n = 30) – животные получали препарат мелаксен ad libium в концентрации 4 мг/литр с питьевой водой в течение 4 недель и находились в условиях обычного освещения (естественное освещение; продолжительность светового дня 8 – 9 часов; освещенность на уровне клеток в утренние часы 50 – 150 люкс, днем в пасмурный день – до 500 люкс, в ясный день – до 1000 люкс, вечером 100 – 200 люкс; влажность воздуха 50 – 70%);

• III    - (n = 30) – животные находились в условиях постоянного затемнения (освещенность в клетках в течение дня составляла 0 – 0,5 люкс) в течение 4 недель и получали питьевую воду и корм без ограничений;

• IV    - (n = 30) – животные получали препарат мелаксен ad libium в концентрации 4 мг/литр с питьевой водой в течение 4 недель и находились в условиях постоянного затемнения (освещенность в клетках в течение дня составляла 0 – 0,5 люкс).

Селезенка у животных забиралась после декапитации на 28-е сутки эксперимента во второй половине дня (1500 – 1700). Все действия, предусматривавшие контакт с лабораторными животными, осуществлялись с учетом требований «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» («Приказ МЗ РФ от 19.06.2003 г. №267) и в соответствии с «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях».

Криостатные срезы селезенки толщиной 5 мкм обрабатывались непрямым иммунофлуорес-центным методом по стандартному протоколу: эндогенная пероксидазная активность подавля- лась путем инкубации срезов в 3% растворе H2O2 в течении 30 минут с последующей трехкратной промывкой 0,1 М фосфатным буфером. Блок неспецифического связывания проводился преинкубацией срезов с 10% козьей сывороткой и 0,05% тритоном Х-100. В качестве первичных антител были использованы анти-MHC класс II (1:4; rat anti rat RT1Bu, Class II polymorphic; Serotec, Germany) и анти-Iba-1 (1:400; rabbit polyclonal anti-Iba-1,Wako Chemicals GmbH, Neuss, Germany). Для визуализации MHC-II и Iba-1 использованы меченные флуорохромом вторичные антитела Alexa Fluor 488 (1:250; goat anti rat IgG; Invitrogen) [12]. Препараты анализировались при помощи светового микроскопа Микмед 5, подсчет структур проводился при увеличении 1500.

Результаты исследования и их обсуждение. Введение мелатонина в течение 4-х недель приводит к изменению морфометрических параметров селезенки: увеличивается средний вес селезенки от 0,19 ± 0,02 г в контрольной группе до 0,21 ± 0,05 г. (p = 0,01) во II-й экспериментальной группе и до 0,24 ± 0,03 (p = 0,004) в III-й экспериментальной группе. Увеличивается количество лимфоидных узелков от 4 ± 0,2 в контрольной группе до 15 ± 0,8 во II экспериментальной группе (p = 0,004) и до 17 ± 1,4 (p = 0,001) в III-й экспериментальной группе. Эти результаты определяются способностью мелатонина стимулировать пролиферацию лимфоцитов, которая усиливается у животных, находящихся в условиях затемнения.

Исследование клеток моноцитарно-макрофагального происхождения показывает, что ежедневный введение мелатонина в течение 4 недель животным, находящимся в условиях естественного освещения приводит к уменьшению среднего количества Iba-1-позитивных клеток в 2 раза (p = 0,0006). Наблюдается уменьшение количества Iba-1-позитивных клеток в ПАЛМ и во всех зонах лимфоидных узелков. Исследование красной пульпы селезенки животных, получавших мелатонин, показало уменьшение количества Iba-1-позитивных клеток в маргинальных синусах и увеличение в субкапсулярных синусах красной пульпы (рис. 1).

Введение мелатонина в течение 4 недель животным, находящимся в условиях затемнения приводит к незначительному увеличению среднего количества Iba-1-позитивных клеток, отмечается увеличение количества исследуемых клеток в ПАЛМ, маргинальных зонах лимфоидных узелков и субкапсулярной зоне красной пульпы, что может свидетельствовать об усилении миграции макрофагов из кровотока в пульпу.

Изучение антигенпредставляющих клеток селезенки (MHC II-позитивных) показало, что на введение мелатонина в условиях естественного

■ I□ II □ III □ IV

Рис. 1. Количественная реакция Iba-1- (А) и MHC II-позитивных клеток (B) селезенки мышей на ежедневное введение мелатонина в течение 4-х недель. ПАЛМ — периартериальная лимфоидная муфта, МЗ — мантийная зона лимфоидного узелка, КЗ — маргинальная зона лимфоидного узелка, МС — маргинальный синус, СЗ — зона красной пульпы, расположенная под капсулой органа. I, II, III, IV — экспериментальные группы животных. Достоверность р <0,001 отмечается подчеркиванием числового значения, р <0,01 — двойным подчеркиванием.

освещения они реагируют подобно Iba-1-пози-тивным клеткам. Наблюдается снижение среднего количества клеток в поле зрения в 1,5 раза (p = 0,001), за исключением MHC II-позитивных клеток периартериолярных лимфоидных муфт и краевых зон лимфоидных узелков (рис. 1Б). Чувствительность макрофагов, дендритных и других антигенпрезентирующих клеток, вероятно, объясняется наличием мелатониновых рецепторов МТ3 [7], посредством которых осуществляется иммуномодулирующее действие. Введение мелатонина животным, находящимся в условиях затемнения не приводит к значимым изменениям среднего количества активированных макрофагов, но, можно отметить увеличение количества клеток в ПАЛМ, в маргинальных зонах лимфоидных узелков (рис. 2).

Мелатонин, вводимый перорально в течение четырех недель вызывает морфологические изменения в селезенке:

увеличение количества лимфоидных узелков, более выраженное в селезенке животных, содержавшихся в условиях затемнения;

Рис. 2. Локализация MHC II позитивных клеток в селезенке мышей разных экспериментальных групп: А – III, Б – IV, В — I, Г — II; 1 - лимфоидный узелок, 2 - маргинальный синус. Иммуногистохимическая реакция с анти-MHC. Одно деление шкалы соответствует 22 мкм.

уменьшение среднего количества клеток макрофагального ряда (Iba-1+) и активированных макрофагов (MHCII+) в селезенке животных, содержавшихся при естественном освещении;

незначительные изменения среднего количества клеток макрофагального ряда (Iba -1+) и активированных макрофагов (MHCII+) в селезенке животных, содержавшихся при затемнении.

Наиболее чувствительными к световым условиям содержания животных, которым вводился мелатонин, являются периартериальные лимфоидные муфты, маргинальные и субкапсулярные синусы красной пульпы селезенки.