Морфофункциональное состояние аркуатного ядра гипоталамуса крыс в динамике ожоговой травмы

Ажикова А.К., Самотруева М.А., Смирнов А.В., Замлелов А.А. Морфофункциональное состояние аркуатного ядра гипоталамуса крыс в динамике ожоговой травмы// Морфологические ведомости.- 2020. - Том 28.- № 2.- С. 9-17. (2):9-17

Azhikova AK, Samotrueva MA, Smirnov AV, Zamlelov AA. The morphological and functional state of the arcuate nucleus of the hypothalamus of rats in burn injury dynamics. Morfologicheskie Vedomosti – Morphological Newsletter. 2020;28(2):9-17. (2):9-17

Введение . Ожоговые травмы представляют собой повреждения кожи, репаративный процесс в условиях которых обусловлен комплексом морфологических, физиологических и биохимических нарушений. На фоне термического воздействия наряду с местными деструктивными, дистрофическими, инфекционными проявлениями, в организме наблюдаются признаки иммунного дисбаланса, дисфункции иммунокомпетентных клеток, недостаточная местная резистентность, специфические тканевые изменения. При этом происходит дезорганизация в эмоциогенных зонах головного мозга, формирование и запуск реакций стресс-адаптивного и/или стресс-дезадаптивного характера организма. В этой связи, при изучении патогенеза ожоговых ран кожи особое внимание отводится на выявление особенностей ответа иммунной и нейроэндокринной систем, обеспечивающих регуляторные механизмы активации локальных и системных компенсаторновосстановительных процессов. Подтверждением участия регуляторных систем в репаративных процессах кожи служит тот факт, что иммунокомпетентные клетки и нейроны секретируют в кровь или кожу нейромедиаторы и факторы роста, участвующие в механизмах нейрогенного и иммунологически-индуцированного воспаления кожи. Установлено, что иммунная воспалительная реакция является основным элементом и в патогенезе посттравматических осложнений, и в репарации тканей [1], обеспечивающим поддержание и восстановление гомеостаза наряду со сложными взаимосвязанными нейроэндокринными проводящими путями, гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой осью и симпатической нервной системой [2-6]. С учетом тесной взаимосвязи между кожей, иммунной, нервной и эндокринной системами, исследовательский интерес вызывает роль нарушений функций нейроэндокринной и иммунной систем организма в патогенезе ожоговых повреждений кожи.

В условиях эндогенной интоксикации, возникшей на фоне термической травмы, одним из органов-мишеней выступает головной мозг [8]. Наиболее интенсивнее признаки повреждения нейронов наблюдаются в гипоталамусе [9]. Поскольку гипоталамус входит в состав лимбической системы, ему присущи центральные эмоционально-болевые функции. В условиях стрессового воздействия в развитии патологических изменений гипоталамической области играет роль повышенная проницаемость стенки капилляров, способствующая проникновению в эту зону мозга токсинов, что обуславливает высокую чувствительность гипоталамуса к сдвигам постоянства внутренней среды организма [10]. По литературным данным, ожоговое воздействие вызывает структурные и гуморальные изменения в гипоталамусе, сопровождающиеся повышенными уровнями секреции соматостатина, адренокортикотропного гормона и гормона роста из аденогипофиза [11]. Поскольку гипоталамус является частью нейроэндокринной кооперации, он принимает участие в гуморальной регуляции функций организма путем выделения нейронами ядер гипоталамуса различных гормонов, координирует деятельность всех органов и систем, обеспечивает сохранение гомеостаза организма [12-13].

Одним из наиболее стрессреактивных отделов гипоталамуса является аркуатное ядро [14-16]. В этом ядре сосредоточены гипофизотропные нейроны, секретирующие кортиколиберин – центральный гормон системного ответа на стресс [17, 18]. Особые нейросекреторные клетки аркуатного ядра гипоталамуса участвуют в секреции гормонов передней долей гипофиза [11]. Известно, что аркуатное ядро гипоталамуса контролирует выделение соматотропного гормона, адренокортикотропного гормона, вазопрессина, пролактина, нейропептида Y и агути-подобного пептида [14, 16, 19]; экспрессия нейротензинов регулирует синтез лютеинизирующего гормона [15]. Дофамин, синтезирующийся в дофаминергических нейронах аркуатного ядра и экспрессирующийся из их аксонов в гипофизарный кровоток, модулирует репродуктивную функцию организма, ингибируя секрецию пролактина [8]. Кроме того, установлена способность нейронов дугообразного ядра продуцировать эндорфины (в-эндорфин) и направлять их в прилежащее ядро, тем самым активируя передачу нервного импульса [20-22]. Доказана ключевая роль этого гипоталамического ядра в увеличенной секреции в-эндорфина, определяющего реакцию на стресс на фоне отсутствия алкоголя [9]. Экспериментально показано, что в условиях этаноловой нагрузки акупунктура аркуатного ядра гипоталамуса способствует ослаблению симптомов алкогольной зависимости [17]. Данное обстоятельство подтверждает значение дугообразного ядра гипоталамуса в обеспечении физиологического и адаптационного выхода из стрессовой ситуации, снижении болевых ощущений при влиянии внешних и внутренних стресс-факторов [23].

Несмотря на наличие работ, посвященных исследованию гипоталамических нарушений при термических ожогах кожи [20-21], остается мало изученным вопрос о структурно-функциональных изменениях в аркуатных ядрах гипоталамуса на фоне ожоговой травмы кожи.

Цель исследования : изучение морфологических изменений в аркуатных ядрах гипоталамуса крыс в динамике термической ожоговой травмы кожи.

Материалы и методы исследования. Исследование проведено на белых лабораторных крысах-самцах массой 200-230 г. Содержание животных соответствовало положениям Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 1986), Хельсинкской декларацией, принятой Генеральной ассамблеей Всемирной медицинской ассоциации (1964-2013), Минздрава России №199н от 01.04.2016г. «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики» (GLP), требованиями комиссии Российского национального комитета по биоэтике при Российской академии наук. Лабораторные животные были разделены на 5 групп по десять животных в каждой группе: 1-я группа животных, не подвергшихся ожоговому воздействию - интактная (контроль); 2-я группа животных, подвергшихся ожоговому воздействию и выведенных из эксперимента в первую фазу воспалительно-регенеративной реакции (на 2 сутки после ожога); 3-я группа животных, подвергшихся ожоговому воздействию и выведенных из эксперимента в первую фазу воспалительно-регенеративной реакции (на 4 сутки после ожога); 4-я группа животных, подвергшихся ожоговому воздействию и выведенных из эксперимента во вторую фазу воспалительно-регенеративной реакции (на 7 сутки после ожога); 5-я группа животных, подвергшихся ожоговому воздействию и выведенных из эксперимента в третью фазу воспалительно-регенеративной реакции (на 10 сутки после ожога).

Ожоговое воздействие моделировали у всех подопытных групп путем нанесения контактной термической травмы в межлопаточной области в условиях эфирной наркотизации. На депилированный участок кожи накладывали медный предмет диаметром 1,5 см, нагретый в кипящей воде до 100° С, с экспозицией 5 с. Животных выводили из эксперимента на 2, 4, 7, 10 сутки после ожогового воздействия для сравнительной оценки изменений во всех стадиях ожогового процесса. Декапитацию проводили в условиях эфирной наркотизации, образцы головного мозга фиксировали в 10 %-м забуференном нейтральном формалине. По стандартной методике изготавливали парафиновые блоки и срезы толщиной 5–7 мкм, окрашивали толуидиновым синим по методу Ниссля. Проводили качественный и количественный анализ аркуатных ядер гипоталамуса. Исследование микропрепаратов проводилось с помощью микроскопа «Axio Lab. A1», фотодокументирование осуществляли камерой «AxioCam 105 color».

Функциональную активность аркуатных ядер гипоталамуса оценивали по количественному анализу морфометрических параметров ядер нейроцитов, поскольку эти органоиды коррелируют с интенсивностью транскрипции и могут служить инструментом оценки их функционального состояния [15]. Для проведения количественного анализа гистологических препаратов определялись планиметрические свойства нейронов и их структур: абсолютные показатели нейронов, такие как: площадь перикарионов, площадь ядер нейронов, площадь цитоплазмы нейронов, ядерно-цитоплазматическое отношение нейронов аркуатных ядер гипоталамуса. На основании полученных абсолютных показателей нейронов рассчитаны относительные показатели - медиана площади перикарионов, медиана площади ядер, медиана площади цитоплазмы перикарионов, медиана ядерно-цитоплазматического отношения нейронов аркуатных ядер гипоталамуса.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакетов программ Excell и Statistica 10,0. Данные представляли в виде медианы с указанием интерквартильного интервала. Различия между группами оценивали по критерию критерия Краскела-Уоллиса, и считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты исследования и обсуждение. Нейротопографическая организация аркуатных ядер гипоталамуса интактных животных определялась нормальным положением, формой и размерами. Тканевая организация данной области была представлена преимущественно нейронами и клетками глии. Нейроны характеризовались мономорфизмом; форма перикарионов была преимущественно неправильной и звездчатой (рис. 1).

При морфологическом исследовании аркуатных ядер у интакных животных контрольной группы нейроны характеризовались наличием пузырьковидного центрально расположенного ядра. Определялись перицеллюлярно расположенные отечные вакуоли, в единичных случаях имелась вакуолизация цитоплазмы перикариона, процессы вакуолизации были выражены слабо-умеренно, отмечалось равномерное распределение базофильной субстанции в цитоплазме ядер. Ядра наблюдались с умеренно выраженным диффузным гиперхроматозом. Расположение ядрышек преимущественно было центральное, однако встречалось и эксцентрическое положение ядрышек без вытеснения стенки ядра. Ядрышки имели одинаковую округлую форму, приблизительно одинаковый размер и равномерное распределение окраски. Нейроны характеризовались малым содержанием цитоплазмы, местами цитоплазма перикарионов не визуализировалась. Цитоплазма перикарионов имела глыбки базофильной субстанции со слабо выраженной интенсивностью окрашивания и малым содержанием хроматофильного вещества.

В менее половины случаев определялись сморщенные нейроны в разной степени выраженности. Цитоплазма таких перикарионов характеризовалась выраженным гиперхроматозом, неравномерностью распределения глыбок базофильной субстанции. Цитоплазма данных ядер характеризовалась диффузным гиперхроматозом. Количество ядрышек было преимущественно одно, в единичных случаях определялось два ядрышка, ядрышки занимали как центральное, так и эксцентрическое положение, одного размера, при этом эксцентрично расположенные ядрышки цитоплазму ядра не выпячивали.

Среди нейронов определялись неизмененные клетки глии. Глия в межклеточном пространстве характеризовалась слабо выраженным спонгиозом, сосуды визуально не определялись. По периферии глиальных клеток отмечались отечные изменения. Определялись нейроны с выраженым сморщиванием. Данные нейроны имели неправильную форму. Ядра данных нейронов не были четко очерчены из-за выраженной гиперхромности цитоплазмы. В целом данные нейроны были резко уменьшены, расценивались как в состоянии тяжелого повреждения, количеством 5-7 единиц в поле зрения (рис. 2).

При микроскопическом исследовании аркуатных ядер животных 2-й группы (2-е сутки ожога) определялись следующие характеристики, явившиеся отличительными чертами и были выражены в наибольшей степени по сравнению с интактной группой животных. Как и в интактной группе животных расположение ядрышек определялось преимущественно центральное, однако, встречались ядра с эксцентрическим положение ядрышек, а также вытеснение стенки ядра данными ядрышками в единичных случаях. Определялись нейроны, имеющие более выраженную (базофильную) окраску ядер с гиперхроматозом цитоплазмы перикарионов. Эти нейроны были сморщены в разной степени, от слабой до умеренно выраженной. Глия в межклеточном пространстве характеризовалась средне выраженным спонгиозом, определялось полнокровие сосудов в данной анатомической области (рис. 3).

При микроскопическом исследовании гистопрепаратов аркуатных ядер животных 3й группы (4-е сутки ожога) определялся умеренный и выраженный гиперхроматоз цитоплазмы. Определялись немногочисленные нейроны с двумя ядрышками в ядре. В половине общего объема нейронов, нейроны были с выраженым сморщиванием перикарионов и ядер. Глия в межклеточном пространстве характеризовалась умеренно выраженным спонгиозом. По периферии глиальных клеток отмечалось разряжение глии в виде щелей (рис. 4).

При микроскопическом исследовании гистопрепаратов аркуатных ядер животных 4й группы (7-е сутки ожога) определялись увеличения размеров ядер нейронов, немногочисленные нейроны с выраженным сморщиванием перикарионов и ядер. Глия в межклеточном пространстве характеризовалась умеренно выраженным спонгиозом, на рядах срезов отмечался выраженный спонгиоз в виде диффузно распространенных оптически пустых вакуолей размером до ядра, сосуды визуально не определялись. По периферии глиальных клеток отмечалось разряжение глии в виде щелей (рис. 5).

При микроскопическом исследовании гистопрепаратов аркуатных ядер животных 5й группы на 10-е сутки ожога определялись выраженно сморщенные нейроны, ядрышки не визуализировались, данные нейроны имели резко уменьшенный размер, определялись как в состоянии тяжелого повреждения (около 5 элементов в поле зрения). В незначительном количестве, определялись гиперхромные скопления темно-базофильных субстанций -вероятно погибшие нейроны (от 4 до 11 шт). Глия в межклеточном пространстве характеризовалась умеренно выраженным спонгиозом, на рядах срезов отмечался выраженный спонгиоз в виде диффузно распространенных оптически пустых вакуолей размером до ядра, сосуды визуально не определялись, по периферии глиальных клеток отмечалось разряжение глии в виде щелей (рис. 6).

При морфометрической оценке абсолютных показателей нейронов аркуатных ядер гипоталамуса животных, подвергшихся ожоговому воздействию, было выявлено, что площадь перикарионов на 2 сутки после ожога уменьшилась на 7,02 %, р<0,05 [интактная группа - Ме=61,18 [52,75; 72,84] мкм2], 2-я группа - Ме=56,88 [50,47; 65,57] мкм2], но восстанавливалась на 4, 7, 10 сутки (Ме=9,35 [49,94; 69,23], 62,19 [51,67;80,51], 59,52 [49,22; 75,26 мкм2] соответственно, табл. 1, рис.7).

Также установлено, что площадь ядер нейронов уменьшилась во все сроки послеожогового периода: на 2 сутки - на 7,58 %, р<0,05 (Ме=44,51[38,74; 52,07] мкм2), на 4 сутки - на 5,81 %, р<0,05 (Ме=45,36 [38,57; 52,89] мкм2), на 7 сутки - на 4,28 %, р<0,05 (Ме=46,10 [40,41;57,58] мкм2), на 10 сутки - на 6,85 %, р<0,05 (Ме=44,86 [37,16; 56,01] мкм2), по сравнению с показателями интактных животных [Ме=48,16 [40,72; 56,95] мкм2].

В результате исследования выявлено, что площадь цитоплазмы нейронов на 2 сутки после ожога уменьшилась на 7 %, р<0,05 (Ме=11,95 [9,77;15,16] мкм2), однако имела тенденцию к увеличению на 4 и 10 сутки - увеличиваясь на 5,68 % на 4 сутки (Ме=13,58 [10,29; 17,26] мкм2) и на 7,16 % на 10 сутки (Ме=13,77 [10,08; 19,34] мкм2), достигая пика на 7 сутки эксперимента - увеличиваясь на 13,15 % (Ме=14,54 [10,37; 23,77] мкм2), по сравнению с показателями интактных животных [Ме=12,85 [9,95; 17,46] мкм2].

Также доказано статистически значимое уменьшение ядерно-цитоплазматического отношения нейронов аркуатных ядер гипоталамуса - на 1,3 %, р<0,05 на 2 сутки после ожога (Ме=3,81 [2,91; 2.09] мкм2), на 11,66 % на 4 сутки (Ме=3,41 [2,55; 4,36] мкм2), на 19,17 % на 7 сутки (Ме 3,12 [2,01; 4,34] мкм²), на 12,7 % на 10 сутки (Ме 3,37 [2,43; 4,26] мкм²), по сравнению с показателями интактных животных [Ме 3,86 [2,64; 4,85] мкм2].

Рис. 1. Нейротопографическая организация аркуатных ядер гипоталамуса интактных животных. Окр.: толуидиновым синим по методу Ниссля. Ув.: х100.

Рис. 2. Нейроны аркуатных ядер гипоталамуса интактных животных., Окр.: толуидиновым синим по методу Ниссля. Ув.: х400.

Рис. 3. Нейроны аркуатных ядер гипоталамуса животных 2-й группы. Окр.: толуидиновым синим по методу Ниссля. Ув.: х400.

Рис. 4. Нейроны аркуатных ядер гипоталамуса животных 3-й группы. Окр.: толуидиновым синим по методу Ниссля. Ув.: х400.

Рис. 5. Нейроны аркуатных ядер гипоталамуса животных 4-й группы. Окр.: толуидиновым синим по методу Ниссля. Ув.: х400.

Рис. 6. Нейроны аркуатных ядер гипоталамуса животных 5-й группы. Окр.: толуидиновым синим по методу Ниссля. Ув.: х400.

Медианы площади перикарионов нейронов аркуатных ядер у интактных крыс и при моделировании

Интакт Ожог, 4 сутки Ожог, 10 сутки □ 25%-75%

Ожог, 2 сутки Ожог, 7 сутки                    INon-Outlier Range

Медианы площади ядер нейронов аркуатных ядер у интактных крыс и при моделировании ожогового

Интакт Ожог, 4 сутки Ожог, 10 сутки Q25%-75% Ожог, 2 сутки Ожог, 7 сутки                    I Non-Outlier Range

Медианы площади цитоплазмы перикаионов нейронов аркуатных ядер у интактных крыс и при

Интакт Ожог, 4 сутки Ожог, 10 сутки П25%-75%

Ожог, 2 сутки Ожог, 7 сутки                     I Non-Outlier Range

Рис. 7. Диаграмма изменения площади перикарионов нейронов, площади ядер нейронов, площади цитоплазмы перикарионов, ядерно-цитоплазматического отношения нейронов аркуатного ядра гипоталамуса экспериментальных животных.

Таблица 1

Ядерно-цитоплазматическое отношение нейронов аркуатных ядер у интактных крыс и при

Интакт Ожог, 4 сутки Ожог, 10 сутки □25%-75%

Ожог, 2 сутки Ожог, 7 сутки                     I Non-Outlier Range

Морфометрические показатели нейронов аркуатных ядер гипоталамуса

	Медиана [нижний квартиль; верхний квартиль])
Экспериментальные группы, n=10	Интактная группа	Ожог, на 2-е сутки	Ожог, на 4 –е сутки	Ожог, на 7-е сутки	Ожог, на 10-е сутки
Медиана площади перикарионов, мкм²	Kruskal-Wallis test: H (4, N= 655) =9,259331, p<0,05*
	61,18 [52,75; 72,84]	56,88 [50,47; 65,57]	59,35 [49,94; 69,23]	62,19 [51,67; 80,51]	59,52 [49,22; 75,26]
Медиана площади ядер, мкм²	Kruskal-Wallis test: H (4, N= 623) =6,040175, p<0,05*
	48,16 [40,72; 56,95]	44,51 [38,74; 52,07]	45,36 [38,57; 52,89]	46,10 [40,41; 57,58]	44,86 [37,16; 56,01]
Медиана площади цитоплазмы перикарионов, мкм²	Kruskal-Wallis test: H (4, N= 655) =12,93823, p<0,05*
	12,85 [9,95; 17,46]	11,95 [9,77; 15,16]	13,58 [10,29; 17,26]	14,54 [10,37; 23,77]	13,77 [10,08; 19,34]
Медиана ядерно-цитоплазматического отношения нейронов, число	Kruskal-Wallis test: H (4, N= 655) =17,00863, p<0,05*
	3,86 [2,64; 4,85]	3,81 [2,91; 2.09]	3,41 [2,55; 4,36]	3,12 [2,01; 4,34]	3,37 [2,43; 4,26]

Примечание* - различия между группами статистически значимы

Заключение. Исходя из полученных при качественном и количественном анализе данных, можно сделать вывод о том, что выявленные морфологические изменения гипоталамуса лабораторных животных в условиях термической травмы кожи на протяжении 10 дней отражают развитие процессов обратимого и необратимого повреждения нейронов, в аркуатных гипоталамических ядрах, что в целом соответствует существующим представлениям о выраженном повреждении нейронов в этой зоне за счет реализации компенсаторно-приспособительных процессов, характеризующихся очаговым глиозом и развитием отечных изменений нервных клеток.