Морфофункциональное состояние кишечного барьера биомодели при введении холерных вибрионов О139 серогруппы штаммов с разным набором детерминант вирулентности

Морфологическими эквивалентами проявления функционирования тех или иных генов холерного вибриона в макроорганизме являются нарушения, возникающие в ответ на инокуляцию микроба, в виде развития различных патологических или адаптационно-компенсаторных реакций. При моделировании холерной инфекции желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) биомоделей обеспечивает первую линию защиты макроорганизма, выступая местом тесного взаимодействия патогена с его функциональными системами и, в первую очередь, индуктивной и эффекторной зонами иммунной [6] и нейроэндокринной системами.

В силу высокого эпидемического потенциала и склонности к быстрому распространению, холерные вибрионы О139 серогруппы долгое время признавались в качестве второго этиологического агента эпидемической холеры. Как и представители О1 серогруппы, холерные вибрионы О139 серогруппы неоднозначны в отношении эпидемического потенциала, определяемого наличием хромосомного «острова патогенности» [2]. В реализации холерного инфекционного процесса в макроорганизме ключевая роль отводится следующим детерминантам вирулентности патогена – токсин-корегулируемым пилям адгезии и холерному токсину, синтез которых кодируют соответствующие гены tcpА-F и ctxAB [10].

Цель исследования - сравнительная морфофункциональная характеристика реакции апудоцитов и клеток эффекторной зоны иммунной системы кишечника у крольчат, зараженных холерными вибрионами О139 серогруппы ctxA+, tcpA+ и ctxA-, tcpA- штаммов.

Материалы и методы исследования. В работе использовали 5 штаммов холерных вибрионов О139 серогруппы, выделенных из различных источников (табл. 1). Для выявления tcpА гена в полиимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали олигонуклеотидные праймеры, предложенные S.P. Keasler, R.H. Hall [9], проводя амплификацию фрагмента tcpА гена с данным праймером в соответствии с авторскими рекомендациями. Идентификацию штаммов Vibrio cholerae (ctxA+) проводили с использованием тест-системы «ГенХол - для выявления ДНК V.cholerae (ctxA+) методом ПЦР» (ТУ 8895-00601898109-2007, производства ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб»). Работу выполняли в соответствии с инструкцией к препарату.

Экспериментальную холеру воспроизводили на крольчатах (16 особей) 7-8 дневного воз-

Таблица 1

Характеристика штаммов V. cholerae О139 серогруппы, используемых в работе

% опустошен, апудоцитов + % гистохимически активных апудоцит Иан = ---------—------------------;----------------------------- % клеток в состоянии функционального покоя

раста, массой 130-150 г [8], заражая животных культурой V.cholerae О139 в дозе 1х107 КОЕ. Животных разделили на группы: 1-я группа – для заражения использовали штаммы, в геноме которых присутствовали гены ctxA, tcpA; 2-я группа – заражали культурами штаммов с отсутствующими генами ctxA, tcpA. Контрольным животным (3 особи) в аналогичных опытным условиях внутрикишечно вводили 0,2 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. Павших и через 48 ч наблюдения усыпленных хлороформом животных вскрывали, оценивая патоморфологические изменения. Кусочки органов фиксировали в 10% водном нейтральном растворе формалина и обрабатывали по общепринятой в гистологии схеме обезвоживания и заливки материала в парафин [3]. Полутонкие парафиновые срезы кишечника и внутренних органов окрашивали гематоксилином и эозином, импрегнировали серебром по Гримелиусу, применяли сочетанную окраску альциановым синим и Шифф-реактивом [5]. Эффекторную зону иммунной системы ЖКТ, представленную лимфоидными клетками Lamina propria (собственная пластинка слизистой оболочки - СПС) и межэпителиальными лимфоцитами (МЭЛ), характеризовали, подсчитывая количество клеток на 1000 ядер энтероцитов при увеличении Х 200. Количество бокаловидных клеток (БК) и апудоцитов определяли в 10 полях зрения правильно ориентированных срезов кишечника в 10 повторах при увеличении Х 200. Секреторный профиль БК оценивали по количеству клеток, дающих голубую (кислые мукополисахариды - КМПС), красную (нейтральные мукополисахариды - НМПС) или фиолетовую (смешанные формы) окраску на 100 секреторных клеток. Морфофункциональное состояние апудоцитов определяли по изменению интенсивности окрашивания и зоне распределения продукта секреции в клетке. Индекс активности апудоцитов (Иап) вычисляли по формуле [1]:

Исследования проводили с помощью программы ДММ (версия 2.1.0.0) аппаратнопрограммного комплекса МЕКОС-Ц. Статистическую обработку данных проводили в программе Microsoft Office Excel 2003.

Результаты исследований и их обсуждение. Животные 1-ой группы в 75 % случаев пали в течение 36 ч после заражения. У них отмечали типичные для холерной инфекции изменения в подвздошной кишке и начальных отделах толстого кишечника в виде перерастяжения петель прозрачной, бесцветной, слегка опалесцирующей жидкостью (рис.).

В отличие от заражения холерными вибрионами О1 серогруппы, при гистологическом исследовании в кишечнике крольчат наблюдали проявления воспалительного характера с превалированием пролиферативно-инфильтративных процессов над явлениями отека и дистрофического поражения энтероцитов. Эти изменения в ЖКТ протекали на фоне выраженных токсических повреждений паренхиматозных органов. Не исключено, что такие особенности развития патологического процесса в макроорганизме на введение холерных вибрионов 0139 серогруппы ctxA+, tcpA+ штаммов, обусловлены особенностями строения самого микроорганизма [7]. СПС оболочки была инфильтрирована полиморфонуклеарами (ПМЯЛ) и лимфоцитами. Количество последних достигало 6,9±0,97 клеток в поле зрения среза (в контроле – 4,2±1,17). Для эффекторной зоны иммунной системы кишечника характерным было снижение в 2-2,5 раза количества МЭЛ во всех отделах кишечника на фоне почти двукратного уменьшения количества апудоцитов (табл.2), особенно в тонком кишечнике и изменение их функциональной активности, обусловленной опустошением кле- ток. Так, Иап для тонкого кишечника на введение холерных вибрионов ctxA+, tcpA+ штаммов в среднем в 10 раз превышал аналогичный показатель у контрольных животных. Бокаловидные клетки были гипертрофированы, их число на единицу площади среза увеличивалось по сравнению с контролем, характер секрета в них чаще обусловливали КМПС. Известно, что защитные функции кишечного барьера связывают с НМПС [4], а описанные изменения свидетельствуют о нарушении процессов обновления секрета в клетках.

Крольчата 2-ой группы были умерщвлены через 48 ч наблюдения. При макроскопическом исследовании у них отмечали умеренное полнокровие паренхиматозных органов, гиперемию сосудов серозной оболочки тонкого кишечника. В кишечнике регистрировали умеренное количество слизистого желтоватого содержимого с газом. При гистологическом исследовании у крольчат этой группы регистрировали признаки функционального напряжения клеток паренхимы органов. В тонкой кишке животных наблюдали умеренный отек и полнокровие сосудов подслизистой оболочки, инфильтрацию СПС оболочки и стромы ворсин ПМЯЛ и лимфоцитами. Количество последних достигало 9,6±0,94 клеток в поле зрения среза (в контроле – 4,2±1,17). Количество МЭЛ при этом умеренно повышалось, а реакция апудоцитов заключалась в некотором уменьшении числа клеток без выраженного изменения их функциональной активности (табл.). Увеличивалось количество бокаловидных клеток на единицу площади среза по сравнению с контролем, менялся характер секрета в них, чаще, чем в контроле встречались клетки со смешанным продуктом секреции.

Таким образом, изменения морфофунк-

Рис. Крольчонок-сосунок. Внутрикишечное заражение холерными вибрионами О139 серогруппы ctxA+, tcpA+ штамма. 36 ч после заражения. Выраженный холерогенный эффект.

ционального состояния бокаловидных клеток, апудоцитов и элементов эффекторной зоны иммунной системы кишечника, выполняющих в макроорганизме барьерные функции, при моделировании холерной инфекции, отражали уровень повреждающего действия на эти структуры вибрионов О139 серогруппы штаммов с генотипом ctxA+, tcpA+ и направленность адаптационнокомпенсаторных реакций на введение ctxA- , tcpA- культур. Количественная характеристика барьерных структур биомодели, повышая инфор- мативность исследования, позволяет уточнять роль отдельных детерминант вирулентности в патогенезе патологического процесса.

Таблица 2

Характеристика клеток кишечного барьера крольчат-сосунков, зараженных холерными вибрионами О139 серогруппы

Примечание: * Уровень значимости различий результатов по отношению к контролю p<0,05.