Морфофункциональные особенности гонадотропных эндокриноцитов дистальной части аденогипофиза крыс при экспериментальной иммуносупрессии

Введение. Вопросы взаимодействия иммунной и эндокринной систем относятся к фундаментальным проблемам биологии и медицины [1–3]. Установлено, что различные гормоны способны изменять активность метаболизма и функции различных клеток, в т.ч. клеток иммунной системы [4], и оказывать выраженное модулирующее влияние на течение иммунных реакций [5]. Вместе с тем изменение активности органов иммунной системы может воздействовать на состояние эндокринных функций [6].

Среди биологически активных веществ, оказывающих влияние на иммунный гомеостаз, особый интерес вызывают гормоны дистальной части аденогипофиза, поскольку установлено, что они влияют на различные иммунокомпетентные клетки, ткани и органы иммунной системы [7, 8].

Многочисленные исследования позволили установить, что аденогипофиз чрезвычайно чувствителен к действию различных экзо-и эндогенных факторов [9–12]. Значительно меньшее внимание уделено состоянию аденогипофиза при угнетении иммунной системы. При этом вопрос о морфологических изменениях аденогипофиза при иммуносупрессивном состоянии организма представляет теоретический и практический интерес в связи со значительным контингентом больных, получающих иммунодепрессанты при лечении злокачественных опухолей, аутоиммунных заболеваний, а также в трансплантологии. Осмысление тканевых и клеточных механизмов, лежащих в основе перестройки аденогипофиза при иммунодепрессии, необходимо для возможной коррекции проводимой терапии.

Цель исследования. Изучить особенности структурных преобразований гонадотропных эндокриноцитов дистальной части аденогипофиза крыс репродуктивного периода на фоне экспериментальной иммуносупрессии.

Материалы и методы. Исследование проведено на 60 белых беспородных крысах-самцах репродуктивного периода массой 150–170 г, полученных из вивария лабораторных животных ГУ «Луганский государственный медицинский университет». Иммуносупрессивное состояние у животных моделировали путем введения цитостатического препарата циклофосфамида (циклофосфана), который вводили животным в дозе, приводящей к иммунной депрессии (200 мг/кг массы тела животного), однократно внутримышечно на физиологическом растворе [13, 14]. Контролем служили крысы, получавшие

0,9 % раствор натрия хлорида в эквивалентном объеме. Выведение животных из эксперимента осуществляли через 1, 7, 15, 30 и 60 сут после инъекции препарата путем декапитации под эфирным наркозом [15]. Эксперимент выполнен с соблюдением правил биоэтики, утвержденных Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986), и одобрен комиссией по вопросам биоэтики ГУ «Луганский государственный медицинский университет» (протокол № 1 от 19.01.2013).

Объектом исследования служил гипофиз. После забора материала и стандартной гистологической проводки срезы окрашивали гематоксилином и эозином, что давало возможность определять ацидофильные, базофильные и хромофобные клетки. Для дифференцировки различных видов эндокриноци-тов применяли окраску по методу Маллори, а также Гримелиуса (импрегнация нитратом серебра) [16–18].

Изучение деталей гистологического строения и морфометрические исследования проводили с помощью аппаратно-программного комплекса, включающего микроскоп Olympus CX-41 и цифровой фотоаппарат Olympus SP 500UZ с использованием компьютерной программы Morphology [20]. Кроме общепринятых гистологических методов изучения препаратов под световым микроскопом, проводили морфометрическое исследование гонадотропных эндокриноцитов: цито- и ка-риометрию с определением диаметров, площадей клеток, их ядер, а также площади цитоплазмы с последующим вычислением ядерно-цитоплазматического отношения (ЯЦО).

Для ультрамикроскопического исследования кусочки гипофиза фиксировали и заключали в эпон-аралдит. Просмотр и фотографирование срезов проводили на электронном микроскопе ЕМ-125 (ПО «Электрон», Украина). На ультратонких срезах аденогипофиза определяли относительную площадь, занимаемую ядрышками эндокриноцитов, по отношению к общей площади поперечного сечения ядра; относительную площадь, занимаемую митохондриями и гормонсодержащими гранулами, по отношению к общей площади поперечного сечения цитоплазмы; относительную площадь, занимаемую активными гранулами (активными считали полные гранулы, имеющие типичное строение), а также неактивными гранулами (светлыми, лишенными электронно-плотной субстанции, а также частично или полностью разрушенными), по отношению к общей площади поперечного сечения цитоплазмы; отношение площади активных гормонсодержащих гранул к площади неактивных гранул на фиксированной площади цитоплазмы.

Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики с применением t-критерия Стьюдента. Результаты обработаны при помощи пакета программ Statistica 6.0. Достоверными считали различия при уровне значимости 5 % (р<0,05).

Результаты и обсуждение. Дистальная часть аденогипофиза имеет структуру ком- пактного органа с нежной соединительнотканной стромой и паренхимой, состоящей из тяжей эндокриноцитов. Тяжи клеток плотно прилегают друг к другу, без определенного порядка, разделяясь многочисленными синусоидными капиллярами. Эндокриноциты по форме, размерам и характеру цитоплазмы подразделяются на несколько типов: хромофобные, ацидофильные и базофильные.

Один из видов базофильных эндокрино-цитов – гонадотропные – выявляется на препаратах вблизи кровеносных капилляров, по периферии дистальной части аденогипофиза, а также в виде двух тяжей, идущих вдоль промежуточной части, что согласуется с данными исследований [10, 17, 20]. Гонадотро-поциты контактируют с тиротропными эн-докриноцитами (рис. 1), хромофобными и ацидофильными клетками.

Рис. 1. Аденогипофиз белой крысы-самца репродуктивного периода контрольной группы: 1 – гонадотропный эндокриноцит,

2 – тиротропные эндокриноциты. Окраска по Маллори.

Приближение: Zoom 162. Объектив: Plan CN ×60/0,25∞/-/FN22

Гонадотропные эндокриноциты представляют собой крупные клетки, имеющие форму равнобедренного треугольника, к вершине которого смещено вытянутое ядро. Хроматин образует скопления вдоль внутренней мембраны ядерной оболочки. Ядрышки крупные, эксцентрично расположенные, часто прилежат к ядерной мембране, что свидетельствует об активном белковом синтезе в таких клетках.

Количественные методы исследования позволяют объективно оценить морфофункциональное состояние изучаемых клеток в норме, а также динамику их морфологических преобразований в ответ на воздействие на организм различных факторов.

Показатели диаметра и площади ядра являются общеизвестными критериями интенсивности синтетических процессов в клетке, поскольку увеличение этих показателей происходит в связи с переходом компактного неактивного гетерохроматина в мелкодисперсный эухроматин, с которого идет считывание информации о строении синтезируемого вещества на молекулы РНК. Известно, что в зрелых дифференцированных клетках в условиях нормальной функциональной активности наблюдается определенное соотношение между объемами цитоплазмы и ядра – ЯЦО. Этот показатель в клетках различных тканей характеризуется определенными величинами. При изменении функциональной активности ЯЦО также изменяется. Установление этого показателя позволяет объективно судить о функциональном состоянии определенных клеток. Сопоставление полученных данных экспериментальных и контрольных животных дает возможность оценить уровень функциональной активности гонадотропных эндокриноцитов аденогипофиза в условиях введения цитостатика циклофосфамида.

Исследование дистальной части аденогипофиза экспериментальных животных показало, что гонадотропные эндокриноциты расположены одиночно или группами, состоящими из нескольких клеток. При морфометрическом исследовании статистически значимых изменений численности указанных клеток на протяжении всего периода наблюдения выявлено не было. Не установлены также отличия показателя средней площади гонадотропных эндокриноцитов от контрольных данных. В то же время площадь ядер на 15-е и 30-е сут превышала показатели контрольных животных на 7,16 и 3,06 % соответственно, а ЯЦО было статистически значимо ниже через 1 сут после введения препарата на 4,84 %, в то время как на 7, 15 и 30-е сут наблюдения этот показатель превышал контрольные значения на 7,94, 8,20 и 3,23 % соответственно (рис. 2).

Сроки наблюдения в сутках

—■— S клеток —е— S ядер —*—ЯЦО

Рис. 2. Динамика средней площади клеток, их ядер и ЯЦО гонадотропных эндокриноцитов аденогипофиза крыс репродуктивного периода после введения циклофосфамида (M±m, n=60), %.

* – достоверность различий показателей (р≥0,05)

При электронно-микроскопическом исследовании аденогипофиза через 1 сут после введения препарата гонадотропные эндокри-ноциты имели неправильную удлиненную форму, содержали крупные овальные ядра, в кариоплазме которых различались зерна гетерохроматина, расположенного как диффузно, так и вдоль внутренней ядерной мембраны. Ядрышки (1–3) локализовались возле ядерной оболочки, в которой были видны ядерные поры. В цитоплазме была хорошо развита гранулярная эндоплазматическая сеть, состоящая из большого количества уплощенных цистерн, и комплекс Гольджи. Характерно наличие значительной численности свободных рибосом и полирибосом. Митохондрии, имеющие удлиненную, палочковидную форму, содержали многочисленные кристы, имели высокую электронную плотность матрикса. Гормонсодержащие гранулы, размеры которых варьировали от мелких до крупных, были расположены в участках ци- топлазмы между расширенными цистернами гранулярной эндоплазматической сети.

На 7-е и 15-е сут в клетках развивались различной степени выраженности деструктивно-дистрофические процессы, проявляющиеся в деформации ядер, развитии вакуолизации цитоплазмы (рис. 3). На 30-е сут в го-надотропоцитах наблюдались наиболее глубокие деструктивно-дистрофические изменения. Большая часть клеток имела признаки баллонной дистрофии, образовывались типичные клетки кастрации (рис. 4).

Рис. 3. Гонадотропный эндокриноцит дистальной части аденогипофиза крысы репродуктивного периода через 15 сут после введения циклофосфамида: 1 – деформированное ядро, 2 – вакуолизация цитоплазмы, 3 – митохондрии, 4 – гормонсодержащие гранулы. Ув. ×12000

Рис. 4. Фрагмент гонадотропного эндокриноцита дистальной части аденогипофиза крысы репродуктивного периода через 30 сут после введения циклофосфамида:

1 – ядро, 2 – гигантская вакуоль в цитоплазме,

3 – гормонсодержащие гранулы. Ув. ×12000

Площадь сечения ядрышек, достоверно превышающая через 1 сут наблюдения контрольный показатель на 9,95 %, снижалась на 7, 15 и 30-е сут. Аналогичная динамика была характерна и для площади цитоплазмы, занимаемой митохондриями (рис. 5).

Площадь цитоплазмы, занимаемая гормонсодержащими гранулами, так же как и индекс их активности, была увеличена относительно данных группы контроля через 1 сут после введения циклофосфамида. На 7, 15 и 30-е сут показатели станови- лись ниже данных контрольной групп-пы (рис. 6).

К 60-м сут после введения цитостатика наблюдалось развитие компенсаторно-приспособительных и репаративных процессов, что проявлялось в увеличении числа клеток с незначительными изменениями ультраструктуры. Число клеток кастрации снижалось, а основную часть составляли клетки с мелко-вакуолярной дистрофией цитоплазмы. Морфометрические показатели эндокриноцитов не имели статистически значимых отличий от контрольных данных.

Рис. 5. Динамика относительной площади ядрышек и митохондрий гонадотропных эндокриноцитов аденогипофиза крыс репродуктивного периода после введения циклофосфамида (M±m, n=60), %.

* – достоверность различий показателей (р < 0,05)

—*—S гранул

—•—Индекс активности гранул

Рис. 6. Динамика площади и индекса активности гормонсодержащих гранул гонадотропных эндокриноцитов аденогипофиза крыс репродуктивного периода после введения циклофосфамида (M±m, n=60), %. * – достоверность различий показателей (р≤0,05)

Заключение. Введение циклофосфамида деструктивно-дистрофические изменения подопытным животным репродуктивного периода вызывает активную ответную реакцию гонадотропных эндокриноцитов дистальной части аденогипофиза.

Через 1 сут после введения цитостатика структурные изменения эндокриноцитов свидетельствуют о повышении их функциональной активности (снижение ядерно-цитоплазма-тического отношения, повышение относительной площади ядрышек и митохондрий, секреторных гранул и индекса активности гранул). На 7, 15 и 30-е сут наблюдаются выраженные ядерных и цитоплазматических структур эндокринных клеток, которые подтверждаются динамикой изученных морфометрических показателей (увеличение относительной площади ядер, увеличение ядерно-цитоплазматического отношения, увеличение площади ядрышек, митохондрий, а также секреторных гранул). Причем к 30-м сут выявленные изменения выражены наиболее интенсивно. Через 60 сут после введения циклофосфамида отмечается развитие компенсаторно-приспособительных и репаративных процессов.