Морфологическая и цитометрическая характеристика лейкоцитов крови перепелов в возрастном аспекте

Введение . Перепеловодство – сравнительно молодая, но перспективная и интенсивно развивающаяся отрасль птицеводства. Перепела имеют ряд существенных продуктивно-хозяйственных преимуществ перед другими видами птицы. Так, у перепелов в пять раз выше скорость роста, чем у кур, у них более ранняя яйценоскость (5–6-недельный возраст) [1]. Состояние птицы в разные периоды функционального напряжения можно контролировать по крови, которая способна быстро реагировать на экстремальные внутренние и внешние воздействия изменением своего морфологического и биохимического состава. Клетки крови, особенно лейкоциты, играют центральную роль в неспецифической защите и в иммунологических реакциях. Выздоровление сопровождается восстановлением морфофункциональной характеристики крови [4]. В доступной литературе встречаются сведения о морфологическом составе и биохимических показателях крови японского перепела при использовании различных кормовых добавок [3, 5]. Однако достоверные данные о морфологических и цитометрических параметрах клеток крови японского перепела в постнатальном онтогенезе отсутствуют, что делает актуальным представленные научные исследования.

Цель исследований . Изучение морфологической и цитометрической характеристики лейкоцитов крови перепелов в возрастном аспекте.

Задачи исследований . Провести морфологические и цитометрические исследования лейкоцитов крови японского перепела с суточного до 120-суточного возраста.

Материалы и методы исследований. Исследования были проведены в 2013–2014 гг. на кафедре анатомии, патологической анатомии и хирургии Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины Красноярского государственного аграрного университета. Объектом исследований являлся японский перепел (Coturnix japonica), поступивший из вивария парка флоры и фауны «Роев ручей» (г. Красноярск). Материалом для исследований служила цельная кровь, полученная из наружной яремной вены птиц. Отбор материала осуществляли с суточного до 35-дневного возраста с интервалом в 7 сут, а затем у 60-, 90- и 120-суточных перепелов. Всего исследован материал от 45 гол.

При морфологическом исследовании лейкоцитов для дифференцировки ядер и выявления зернистости клеток мазки крови окрашивали комбинированным методом по Паппенгейму, сочетающим обработку мазков фиксатором Май-Грюнвальда с последующим докрашиванием краской Романовского-Гимза [2]. Окрашенные мазки исследованы на микроскопе «МикМед-6» (Россия) с помощью иммерсионного объектива. Микрофотографирование произведено цифровой камерой CAM V200 (Vision, Австрия). Подсчет лейкоцитарной формулы произведен с использованием одиннадцатиклавишного счетчика.

Цитометрические исследования лейкоцитов проведены при помощи компьютерной системы анализа изображений «ЦитоБиоГрафика» версия 2.1. Определены линейные размеры лейкоцитов и ядер моно-нуклеаров, ядерно-клеточное отношение лимфоцитов (ЯКО).

Статистическую обработку полученных данных проводили на ПК с помощью прикладных программ Microsoft Office Excel 2007. Достоверность возрастных различий цитометрических показателей лейкоцитов определяли с помощью t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при P≤0,05.

Результаты исследований и их обсуждение . Известно, что кровь состоит из жидкой фазы – плазмы и взвешенных в ней форменных элементов – эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов [2]. В зависимости от зернистости цитоплазмы лейкоциты птиц делятся на зернистые (гранулоциты) и незернистые (агрануло-циты). К зернистым лейкоцитам относятся базофильные, эозинофильные и псевдоэозинофильные гранулоциты. Незернистыми клетками являются лимфоциты и моноциты.

Исследование морфологического состава лейкоцитов показали, что лимфоциты – это округлые клетки с крупным округлым или слегка бобовидным ядром красно-фиолетового цвета, с грубыми глыбками хроматина, расположены эксцентрично (рис. 1). Цитоплазма голубого или синего цвета в виде узкого ободка вокруг ядра может иметь просветленную перинуклеарную зону. Изредка встречаются лимфоциты с многочисленными цитоплазматическими выпячиваниями, что является морфологическим признаком активного состояния клеток (рис. 1).

Минимальные диаметры лимфоцитов в разные периоды жизни колебались от 5,7 до 6,4 мкм, что характерно для малых лимфоцитов, максимальные – от 11,1 до 12,3 мкм, что присуще средним лимфоцитам. Незначительное содержание в мазках крови больших лимфоцитов свидетельствовало, на наш взгляд, об интактном состоянии опытной птицы.

Рис. 1. Морфологическая характеристика лейкоцитов крови перепелов: 1 – малый лимфоцит; 2 – средний лимфоцит; 3 – моноцит; 4 – базофил; 5 – эритроцит; 6 – псевдоэозинофил (окраска по Паппенгейму; ув.×1000)

Популяция лимфоцитов представлена преимущественно малыми и средними лимфоцитами, о чем свидетельствовали результаты цитометрических исследований. У суточных перепелов преобладали малые лимфоциты с ядерно-клеточным отношением (ЯКО) от 0,70 до 0,98 ед. (53 %), около 40 % составляли средние лимфоциты с показателями ЯКО от 0,50 до 0,69 ед. Уровень больших лимфоцитов с ЯКО 0,36–0,46 ед. не превышал 7 %. В течение первой недели жизни уровень малых лимфоцитов сократился до 32,5 %, а средних и больших вырос до 55,8 и 12,5 % соответственно. Это соотношение в популяции лимфоцитов сохранилось до 14-суточного возраста. Третья-пятая недели жизни характеризовались ростом относительного содержания больших лимфоцитов, что косвенно указывает на воздействие какого-либо раздражителя на иммунную систему перепелов. На наш взгляд, это могло быть вызвано сменой рациона кормления, колебанием температурного режима, транспортным стрессом и т.д. Дальнейшие исследования показали преобладание в крови перепелов средних лимфоцитов (рис. 2).

Рис. 2. Распределение популяции лимфоцитов периферической крови японского перепела в постнатальном онтогенезе

Второй группой мононуклеаров крови являются моноциты. Это крупные клетки неправильной округлой формы. Ядро слабосегментированное или бобовидное розовато-фиолетового цвета, с грубыми глыбками хроматина. Цитоплазма серовато-голубая, часто вакуолизированная. Исследования показали колебания размеров моноцитов от 9,6 до 14,5 мкм в разные возрастные периоды.

Исследованием гранулоцитарных лейкоцитов установлена следующая морфологическая характеристика псевдоэозинофилов, эозинофилов и базофилов перепелов. Псевдоэозинофильные гранулоциты – округлые клетки с палочковидным или сегментированным, реже округло-овальным ядром. Считается, что форма ядра отражает степень дифференциации клетки. Наиболее зрелыми являются гранулоциты с сегментоядерным ядром [2]. Именно эти клетки преобладали у перепелов в течение всех периодов исследований. Цитоплазма клеток почти бесцветна, заполнена веретеновидными гранулами с заостренными концами красновато-коричневого цвета. Менее заметны среди них мелкие округлые гранулы. Размеры псевдоэози-нофильных гранулоцитов колебались от 7 до 13 мкм, чаще встречались клетки размером 8–11 мкм.

Эозинофилы – крупные округлые клетки с ядром, состоящим из двух крупных сегментов и узкой перемычки между ними. Цитоплазма бледно-голубого цвета, равномерно заполненная округлыми, обособленно расположенными гранулами красного цвета. Размеры клеток в среднем составляли 9–12 мкм.

Базофилы – крупные, округлые клетки с ядрами палочковидной или сегментарной формы, их контуры плохо заметны из-за обилия крупных вишнево-фиолетовых округлых гранул. Размеры базофилов не зависели от возраста птицы и колебались от 8 до 11,5 мкм.

В результате проведенных исследований установлены возрастные особенности соотношения разных видов лейкоцитов. У суточных перепелов кровь характеризовалась преобладанием псевдоэозинофильных гранулоцитов, содержание которых в среднем составило 55,59±1,23 % (табл.). При этом относительное содержание базофильных гранулоцитов зарегистрировано на минимальном уровне – 1,75±0,28 %. За первую неделю жизни количество лимфоцитов увеличилось почти на 19 %, а содержание псевдоэозинофилов сократилось более чем на 14 % (Р≤0,05). В тот же возрастной период отмечался рост числа базофилов на 60 %, содержание моноцитов и эозинофилов практически сохранялось на исходном уровне.

На третьей неделе жизни кровь перепелов приобрела лимфоцитарный профиль, который сохранялся до конца наблюдений. Максимальное содержание лимфоцитов зафиксировано у птицы двухмесячного возраста – 69,42±1,41 %. В этот же период уровень псевдоэозинофильных гранулоцитов упал до минимальных показателей и в среднем составил 20,84±1,01 %, что в 2,6 раза меньше, чем у суточной птицы (Р≤0,01).

Относительное содержание эозинофильных гранулоцитов достоверно отличалось от исходных показателей у птицы 35-суточного возраста (Р≤0,05) и составило 1,71±0,32 %, что представляло собой минимальные значения за весь период исследований. Максимальное содержание эозинофилов отмечено у перепелов 120-суточного возраста (табл.). Количество моноцитов во все периоды исследований характеризовалось относительной стабильностью, их уровень колебался в диапазоне от 4 до 6 %.

Возрастные изменения лейкоцитарной формулы крови перепелов, %

Возраст, сут	Базофилы	Эозинофилы	Псевдоэозинофилы	Лимфоциты	Моноциты
1	1,75±0,28	3,25±0,34	55,59±1,23	34,06±1,32	5,34±0,44
7	2,80±0,31*	3,20±0,37	48,15±0,77*	40,40±0,75*	5,45±0,62
14	1,00±0,27	2,90±0,32	42,40±2,22**	48,80±2,18**	4,20±0,39
21	3,05±0,79	3,25±0,59	28,90±1,96**	59,30±2,16**	5,50±0,59
28	0,75±0,22*	2,45±0,35	29,00±2,09**	62,60±1,86**	5,50±0,60
35	0,61±0,15	1,71±0,32*	35,77±1,98**	56,09±1,74**	5,77±0,63
60	0,21±0,10	3,37±0,56	20,84±1,01**	69,42±1,41**	6,21±0,54
90	0,19±0,09	3,48±0,40	27,78±1,14**	64,78±1,16**	4,07±0,50
120	0,15±0,09	3,54±0,30	26,54±2,12**	64,96±1,99**	4,85±0,55

* P≤0,05; ** Р≤0,01 относительно суточного возраста.

У перепелов трех- и четырехмесячного возраста содержание всех видов лейкоцитов крови стабилизировалось, о чем свидетельствует незначительная вариабельность полученных показателей.

Выводы

• 1.    В крови перепелов присутствуют все виды гранулоцитарных и агранулоцитарных лейкоцитов, морфологическая характеристика которых не меняется в течение жизни птицы.

• 2.    Возрастные изменения соотношения лейкоцитов крови перепелов характеризуются сменой гранулоцитарного профиля на лимфоцитарный в течение первых трёх недель жизни. Окончательная стабилизация клеточного состава крови происходит у двухмесячной птицы.

• 3.    В популяции лимфоцитов суточных перепелов преобладают малые лимфоциты с высокими ядер-но-клеточными показателями. С возрастом повышается содержание средних лимфоцитов, которые становятся преобладающими клетками в течение остального периода постнатального развития.