Морфологическая и таксономическая характеристика цианобактерий содово-соленых озер Забайкалья



выявило ее увеличение относительно актуальной. Значения азотфиксирующей активности находились в пределах от 0,49+0,01 нМ Кг/г ч (по ручью) до 2,64+0,03 нМ N2/r ч (в пруду). Изучение процесса потенциальной денитрифицирующей активности исследуемых проб показало, что максимальная эмиссия закиси азота была зафиксирована в пробе на выходе термальных вод 340,8+2,0 нМ М2О/ г сут. Минимальная денитрифицирующая активность наблюдалась в осадках ручья, вниз по изливу - 50,4+1,0 нМ К2О/г сут.'

Результаты, полученные по потенциальным скоростям изучаемых процессов, показывают, что азотфиксация и денитрификация в источнике Горячинск протекают параллельно, т.е. в одних и тех же точках наблюдалось либо повышение, либо снижение скоростей этих процессов. На основании этих данных можно предположить, что в данной экосистеме поддерживается баланс. азотсодержащих соединений.

Рис. 2. Потенциальные скорости эмиссии СО2, азотфиксации и денитрификации

Таким образом, полученные данные по численности микроорганизмов цикла азота, по определению интенсивности азотфиксации и денитрификации свидетельствуют об активно протекающих процессах круговорота азота в исследуемой экстремальной экосистеме щелочного термального источника Горячинск.

Литература

• 1.    Кузнецов С.И., Саралов А.И., Назина Т.Н. Микробиологические процессы круговорота углерода и азота в озерах. - М.: Наука, 1985. -213с,

• 2.    Степанов А.Л., Лысак Л,В. Методы газовой хроматографии в почвенной микробиологии: учеб,-метод. пособие. - М.: МАКС Пресс, 2002. - 88 с.

Д.Д. Балдакова, А.В.Брянская

Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЦИАНОБАКТЕРИЙ СОДОВО-СОЛЕНЫХ ОЗЕР ЗАБАЙКАЛЬЯ

Из содово-соленых озер Забайкалья были выделены пять культур цианобактерий, изучена их морфология и таксономия. Полученные результаты показали, что цианобактерии являются одной из доминирующих групп планктона и бентоса большинства озер Забайкалья. В изученных озерах были обнаружены ранее не отмеченные виды и мор-фотипы цианобактерий. На основе морфологических и филогенетических данных культуры Суа! и Суа2 отнесены к роду Oscillatoria.

D.D. Baldanova, А. И Bryanskaya

MORPHOLOGYCAL AND TAXONOMYCAL CARACTERIZATION OF CYANOBACTERIA SODA-SALT LAKES OF TRANSBAIKALIA

Five cultures of cyanobacteria from soda-salt lakes of the Transbaikalia were isolated. The morphology and taxonomy of its cultures were investigated. The received results have shown that cyanobacteria are one of dominating groups of a plankton and benthic the majority of lakes of Transbaikalia. New species and morphotypes of cyanobacteria was found. On the basis of morphological and phylogenetic data the cultures Cyal and Cya2 are carried to genera Oscillatoria.

Содово-соленые озера широко распространены в аридных зонах нашей планеты. Они представляют собой уникальные экосистемы, в которых экстремально высокие значения pH сочетаются с высокими концентрациями солей вплоть до насыщающих (Sadler et al, 1980; Vreeland et al, 1980). Такие озера являются местом активной деятельности алкало-фильных микроорганизмов, в том числе цианобактерий (Заварзин 1993), которые выступают основными продуцентами органического (Андреюк и др., 1990; Дубинин и др., 1995; Заварзин, Жилина, 2000).

До недавнего времени работа с цианобактериями проводилась только с использованием классических методов, однако к настоящему моменту уже сделано немало работ по изучению цианобактерий с использованием молекулярно-генетических методов. Основная проблема, затрудняющая исследование цианобактерий более подробно, - это выделения аксеничных культур. Первым этапом, без которого не возможно выделение чистых культур цианобактерий, является изучение их экологии и видового разнообразия в природных условиях.

В ряде озер Байкальского региона ранее были изучены видовое разнообразие и экофизиология цианобактерий (Содовые озера..., 1991, Бочка, 1995, Брянская, 2002), вместе с тем ряд особенностей их экологии, физиологии и разнообразия изучен не полностью.

Целью настоящей работы было определение видового состава, экологии и экофизиологии цианобактерий содово-соленых озер Забайкалья.

Методы исследования

Физико-химические параметры воды озер были определены стандартными методами (Намсараев и др., 2005). В момент исследования озера Хилганта и Горбунка были пересохшими. Химический анализ воды проводили из прикопок глубиной до 60 см, в которых со временем появлялась вода. Накопительные культуры выращивали на модифицированной минеральной среде Кастенхольца (Балданова, Брянская, 2006). Определение видового состава цианобактерий проводили по морфологическим признакам с использованием отечественных определителей (Еленкин, 1949; Гол-лербах и др., 1953). Выделение чистых культур проводили методом повторных пересевов с жидких сред на агаризованные.

Культивирование цианобактерий проводи ли в условиях лабораторного люминостата в непрерывном режиме при температуре 20-25°С. Рост культур отмечали визуально и по изменению оптической плотности клеточных суспензий. Биомасса (прирост) измерялась в относительных единицах на спектрофотометре Cecil 1021 при длине волны 540 нм. Удельную скорость роста бактериальных культур рассчитывали в соответствии с моделью Россо (Rosso et. all, 1995).

На молекулярно-генетическом этапе работы был разработан модифицированный протокол по выделению и очистке ДНК цианобактерий, который показал наибольшую эффективность по сравнению с имеющимися протоколами (Ausubel et. al., 1994; Coombs, Franco, 2003).

Для установления филогенетического положения штаммов анализированы нуклеотидные последовательности фрагментов генов 16S рРНК длиной примерно от 350 до 1500 нуклеотидов.

Гео 16S рРНК амплифицировали со специфичным цианобактериальным праймером CYA359f (GGGGAATTTTCCGCAATGGG) и универсальным эубактериальным праймером 1492г (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT). ПЦР проводили на приборе GeneAmp PCR System 2700 (Applied'Biosystems, США). Продукты ПЦР разделялись в 1% агарозном геле с добавлением этидиум бромида в камере для электрофореза в 0,5 кратном буфере ТВЕ.

Определение нуклеотидной последовательности генов 16S рРНК проводили на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL (Beckman Coulter, США) в соответствии с предлагаемой фирмой инструкцией.

Филогенетический анализ. Для нахождения близкородственных организмов нуклеотидные последовательности генов I6S рРНК сравнивали с последовательностями типовых штаммов по рибосомальной базе данных (Rt)BII - и банка генов национального центра биологической информации [NCBI - ]. Последовательности генов 16S рРНК выравнивали с помощью программы CLUSTALX [Thompson etal., 1994]. Построения филогенетических деревьев производили с помощью пакета программ TREECON [Van de Peer and De Wachter, 1994].

Результаты и обсуждение.

Физико-химические характеристики озер

Исследованные озера являлись мелковод- ными водоемами, максимальная глубина которых не превышала 10 м. Озера имели относительно малую площадь (2,1-12 км2). Температура воды озер в летнее время находилась в пределах от 17 до 34°С. Диапазон значений минерализации воды в озерах находился в широких пределах от 7,5 (оз. Сульфатное) до 128 г/л (оз. Хилганта). Озера Горбунка и Хил-ганта характеризовались нейтральными значениями pH (7,5), озера Ехэ Тором и Сульфатное - щелочными (8,4 и 9,1 соответственно). Содержание карбонатов в исследованных озерах не превышало 30,6 г/л (оз. Тором), минимальное - 1,02 г/л (оз. Сульфатное). Наибольшее количество гидрокарбонатов (3,70 г/л) выявлено в озере Горбунка, наименьшее (0,09 г/л) - в оз. Сульфатное.

Видовой состав цианобактерий

Всего в исследованных экосистемах обнаружено 17 видов, разновидностей и форм цианобактерий, наибольшее их количество зарегистрировано в озерах с низкой минерализацией: Сульфатное (8 вид), наименьшее - в озере с высокой минерализацией Горбунка (1) (табл. 1).

Ведущим является класс Hormogoniophyceae, включающий большинство видов (16), одним видом представлен класс Chroococcophyceae. По разнообразию видового состава следует выделить роды Phormidium (6 видов), Oscillatoria (2 вида) и Anabaena (2 вида). Другие роды были представлены одним видом. -

Таблица 1

Таксономический спектр цианобактерий исследованных содово-соленых озер Забайкалья

Таксоны	Водоемы
	1	2	3	4
Anabaena variabilus/ tenuis Popova	+
A. sibirica (Popova et DegL) Elenk,		-E		+ ;
Gloeocapsa minuta (KCtz.)Hollerb.Ampl.			■+
Microcoleus chthonoplastes (Fl. Dan.) Thur.		4-
Nastoc sp.	+
Oscillatoria brevis (Kilts.) Gom.	1 Th		4-
Os. lacustris (K1eb.) Geitl.	T
Phormidium frigidum Fritsch.	4-		4-
Ph. komarovii Anissima sp.now.	+
Ph. tenue (Menegh.) Gom	4-
Ph. mode (Kutz.) Gom.	+	+
Ph. tenuissimum Woronich.
Ph. sp.		+
Всего	8	4	4	1

Примечание: 1 - оз. Сульфатное, 2-оз. Хилганта, 3 - оз. Тором, 4 - оз. Горбунка.

По литературным данным, для Забайкалья описано 276 видов и разновидностей Cyanophyta. Наши исследования позволяют дополнить списки цианобактерий еще 8 широко распространенными, но ранее не отмеченными видами. Таким образом, с учетом наших данных в водоемах Байкальского региона описано 284 таксона цианобактерий.

В результате подробного изучения данной группы организмов были выявлены некоторые особенности их морфологии и экологии. Виды рода Gloeocapsa не являются широко распространенными и, хотя чаще развиваются в почвах и минеральных источниках, Gloeocapsa minuta впервые была обнаружена в щелочном озере Тором. Oscillatoria brevis и Os. lacustris также были выявлены впервые.

Отмеченные виды Phormidium широко распространены в содово-соленых водоемах. Однако Phormidium frigidum, часто встречавшийся в исследуемых водоемах, предыдущими исследователями выявлен не был. Microcoleus chthonoplastes широко распространен в содовых водоемах, поэтому его нахождение в оз. Хилганта не удивительно.

Очевидно, что минерализация и активная реакция среды влияют на видовой состав цианобактерий, обусловливая преимущественное развитие тех или иных форм. Так, в озерах с высокой минерализацией нитчатые формы преобладали над одноклеточными. Следует отметить, что такое соотношение форм закономерно, так как нитчатые формы обладают большим количеством защитных свойств, та- ких как прочная клеточная стенка, дополнительные чехлы и т.д. Цианобактерии способны выдерживать широкий интервал солености, однако более интенсивно они развиваются в водоемах с невысокими значениями этого параметра.

Полученные нами данные расширяют представление о видовом разнообразии цианобактерий в содово-соленых водоемах Забайкалья и позволяют внести некоторые дополнения к морфологическому и экологиче скому описанию видов.

Морфологическая характеристика выделенных культур цианобактерий

В результате проведенных экспериментальных работ по выделению культур цианобактерий из матов содово-соленых озер Забайкалья (озера Сульфатное, Хилганта, Горбунка, Тором) было получено пять чистых культур(табл. 2)

Таблица 2

Список культур цианобактерий, выделенных из содово-соленых озер Забайкалья

Штамм	Культура	Водоем
Суа 1	Osciilatoria brevis	Оз. Сульфатное
Суа 2	О. brevis	Оз. Тором
Суа 4	Phormidium frigidum	Оз. Сульфатное          ■
Суа 5	Anabaena variabilis	Оз. Хилганта
Суа 6	A. variabilis	Оз. Горбунка

Культуры (штаммы) Cyal и Суа2 были выделены из разных озер и по морфологическим характеристикам соответствовали Oscillaloria brevis (KQts.) Gom. Однако имелись некоторые отличия между штаммами: Cyal не имел грануляций или грануляция появлялась со временем, длина клеток меньше ширины до 4-х раз (1,25 мкм), тогда как у Суа2 длина клеток меньше ширины до 2-х раз (2,5 мкм); у Cyal часто наблюдались двояковогнутые клетки более темного цвета, чем основные; конечные клетки у Суа2 удлиненные и закругленные. Возможно, эти два штамма представляли собой разные формы этого вида.

Культура (штамм) Суа4, выделенная из низкоминерализованного и щелочного озера Сульфатное, по морфологии была идентична Phormidium frigidum 1'ritsch Но имелись некоторые расхождения от стандартного вида: размеры клеток варьировали от боченкооб-разнь!х до удлиненных, длина которых немного превышала ширину.

Культуры (штаммы) Суа5 н Суаб были выделены соответственно из оз. Хилганта и Горбунка. В результате микроскопирования штаммы были отнесены к виду Anabaena variabilis. Клетки Суа5 в большинстве случаев суженные, конечная клетка закругленная, гетероцисты одиночные, расположены в сере дине трихомов. Суаб характеризовался наличием спор, которые встречались очень редко, шаровидные, 6,25 мкм в диаметре, с гладкой бесцветной оболочкой, расположены вне связи от гетероцистами.

Таким образом, из изученных содовосоленых озер Забайкалья были обнаружены и выделены в культуры ранее не отмеченные виды и морфотипы цианобактерий.

Таксономическая характеристика выделенных культур цианобактерий

Филогенетический анализ выделенных культур проведен на основе генов 16S рРНК. Рестрикционные профили генов 16S рРНК показали близость культур Cyal и Суа2 на видовом / родовом уровне (рис. 1). Для определения их филогенетического положения была выбрана культура Суа 2.

Амплификация и секвенирование гена 16S рРНК проводилась с помощью специфичных цианобактериальных праймеров. В результате анализа было установлено, что культура Суа 2 имела 99,2% сходства no 16S рРНК с Phormidium sp. NIVA-CYA 202 и 98,6-98,9% сходства с Oscillaloria sp. Ant-G17, Oscillaloria sp. Ant-Salt, Phormidium lumbricale UTCC 476, Phormidium ' sp. Ant-Brack-3, Phormidium pseudopristleyi ' ANT.ACEV5.3 (табл. 3).

На основе морфологических признаков и филогенетических данных культуры Cyal и Суа2 отнесены к роду Oscillatoria. Обнаруженный кластер, включающий около 10 фи- логенетически близких культур (рис. 2), может явиться перспективной моделью для изучения вопросов таксономии рода Oscillatoria.

Рис. 1. Рестрикционные профили штаммовСуа! н Суа2

Таблица 3

Наиболее близкие организмы штамму Суа2 (на основе анализа генов 16S рРНК)

Штамм	Ближайшие родственники (% по 16S рРНК сходства)	Номер в GenBank	Публикации
СуаЗ	Phormidium sp. N1VA-CYA 202 (99.2%) Oscillatoria sp. Ant-Gl7 (98.9%) Oscillatoria sp. Ant-Salt (98.9%) Phormidium sp. Ant-Brack-3 (98.9%) Phormidium lumbricale UTCC 476 (98.6%) Phormidium pseudopristleyi ANT.ACEV5.3 (98.9%) CyalO* (89.0%)	Z82794 AF263334 AF263334 AF263332AF21 8375 AY4V36O0	Rudi et al. (1997) Nadeau et al. (2001) Nadeau et al. (2001) Nadeau et al. (2001) Casamatta et al. (2005) Taton et al. (2006); Nadeau et al. (2001)

Примечание: * - штамм Cyal 0 не рассматривался в данной работе.

Из таблицы 3 видно, что уровень сходства Суа2 с Cyal 0 находятся на межродовом уровне (~89.0%) или же входят в один род, чо далекие друг от друга виды (межвидовой уровень). Т.к. представители семейства Pseudanabaenaceae имяот с Суа2 и СуаЮ сходства - 86%. при том входит в другое семейство, можно предположить, что Суа2 и СуаЮ представляют разные роды -Oscillatoria и Phormodium соответственно.

В «езультате филогенетического анализа выделенных культур было установлено, что штахмы Cyal и Суа2 на 98,9% являются представителями рода Oscillatoria, что подтверждает принадлежность этого штамма к роду Oscillatoria на основе морфологических данных.

Полученные результаты показали, что цианобактерии являются одной из доминирующих групп планктона и бентоса большинства озер Забайкалья. В изученных озерах были обнаружены ранее не отмеченные виды и морфотипы цианобактерий. На основе морфологических признаков и филогенетических данных культуры Cyal и Суа2 отнесены к роду Oscillatoria.

Phcaraidiu» эр. Ari-Bteck-3

- Phormidnjin lambhcale UTCC476 OsciUctorta $p. Ant-Sell OscAlfdcriasp. Art-GI7

Phormidiwtpseudcprisfleyi ANTACEV53 j- Phamidium _T. NIVA-CYA 202

T- Cy*2

Cbdllatcria acuminata

Phormidium cf. terebrifcrmic KR2003/25 Oscillatorto cancta PCC 7515

• - Pharmidii#n murrtyi ANT.ACEV5.2 Mcroooteus cHVssMcpIastes PCC7420

  0Л2

  

  Рис. 2. Филогенетическое дерево, сконструированное на основе 16S рРНК, показывает положение культур Суа2 и СуаЮ, полученных из матов содово-соленых озер Байкальского региона в составе семейства Oscillator!ales. Масштаб соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. В качестве «внешней группы» использована нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК Gloebacier sp. PCC 8105

  
  

Osciuatoria negecto

Lq?to ANT .MANNING.!

1ПП Г L^tdyngtya tenerrima UTCC 77

^ Ley*Ayn^ya«viget 473 _